芪杉胶囊对肺癌A549细胞PI3KAKt信号通路影响的研究

隋雨桐，迟文成，姜家康

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中约 80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，肺癌的发生、发展、转移及复发是由多条信号转导通路调节、多因素参与的复杂过程。研究证明 PI3K/Akt 信号通路在肺癌的发生、发展中起重要作用，PI3K/Akt 信号通路的激活在肺癌中很常见，被认为是癌细胞存活的重要通路，该信号转导通路的异常，可导致细胞异常增殖引起肿瘤[1-4]。

本研究所用芪杉胶囊以益气健脾、养阴润肺、解毒消癥为法组方，以健脾补中调理气机为先，兼清热解毒散结。前期根据多年的随访和治疗的临床观察，发现该复方不仅可以明显改善患者的机体免疫力，还可以减轻疾病给患者带来的痛苦，除增加患者的生存率外，在增加患者生存质量，减少肿瘤浸润与转移方面也取得了很好的疗效。故本研究主要探究芪杉胶囊对肺癌A549细胞PI3KAKt信号通路的影响，以期为临床治疗NSCLC提供可行性实验依据。

1 实验材料

1.1 试剂

A549人肺癌细胞株，购自于上海富恒生物科技有限公司；RPMI1640培养基(批号：ABB212917)、PBS缓冲液(批号：AB10100599)，购于Hyclone公司；CellTiter 96®AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒，购于美国Promega公司(批号：000125538)；Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒(批号：CA1120)，购于杭州联科生物技术股份有限公司；mTOR(批号：2972S)、PI3K(批号：3811S)、AKT(批号：9272S)、Caspase-3(批号：9665S)、Caspase-9(批号：9502S)、Cytochrome c(批号：4272S)一抗，购于美国Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量试剂盒(批号：CW0014S)；RIPA加强型裂解液(批号：CW2333S)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(批号：CW0022S)；蛋白酶抑制剂混合物(批号：CW2200S)；过硫酸铵(APS)(批号：CW0032S)；四甲基乙二胺(TEMED)(批号：CW0034S)；蛋白示踪上样缓冲液(批号：CW0052S)；Tris-Glycine SDS电泳缓冲液(批号：CW0045S)；Tris-Glycine转膜缓冲液(批号：CW0044S)；TBST(批号：CW0043S)；高灵敏度化学发光检测试剂盒(批号：CW0049M)；Western Blot封闭奶粉(批号：CW2134S)；醋酸纤维素膜(NC膜)，购于美国Pall Life Sciences公司(批号：66485)；超纯RNA提取试剂盒(批号：CW0581S)，HiFi-MMLV cDNA Syntheses Kit(批号：CW0744M)，UltraSYBR Mixture(High ROX)(批号：CW2602M)，5x RNA Loading Buffer(批号：CW0611S)，DNase 1(RNase Free)(批号：CW2090S)，购于北京康为世纪生物有限公司。

1.2 仪器

超净工作台(上海苏静实业有限公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)；低温高速离心机(德国Beckman公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；转膜设备(美国Bio-Rad公司)；成像系统(美国Bio-Rad公司)；荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；分光光度计(美国Thermo scientific公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 含药血清的制备

Wistar雄性大鼠随机分成空白组、芪杉胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组和顺铂组。根据临床成人用药剂量的1/2、1和2倍为芪杉胶囊低、中、高剂量，灌胃给药剂量为8.35 g/kg，16.14 g/kg，36.57 g/kg，连续灌胃3 d，第3天完成灌药1 h后，乙醚麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，将取得的血样静置1 h以上，离心2 500 r/min，4℃，10 min后取血清，按组别混合，56℃，30 min灭活，分装，-2℃冰箱保存。

1.3.2 细胞培养

将冻存的肿瘤细胞株于37℃迅速溶解，将细胞悬液加入到含有血清的培养基中，离心3 000 r/min，3 min。弃去上层培养基，加入含血清培养基，轻轻吹打细胞沉淀后，加入到T25 cm2细胞培养瓶中，至37 ℃细胞培养箱中培养。细胞培养瓶中长至80%～90%时，将培养瓶中细胞培养液倒掉，加入1 mL胰酶消化液润洗细胞表面。倒掉胰酶，再加入2 mL胰酶，进行消化。消化3 min，加入含血清培养基，轻轻吹打细胞。按1∶3传代，每3天传代1次。细胞消化步骤同上，倒掉上层液体，加入细胞冻存液。吹打均匀后，分装到细胞冻存管中，置于细胞冻存盒中，-80℃冰箱保存。

1.3.3 MTT法检测含药血清对A549细胞增殖的影响

将处于对数生长期的A549细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度至4×104个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔体积为100 μL。置二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2条件下孵育过夜。次日，弃去孔内培养基。实验设含药血清高、中、低剂量组和空白对照组，各剂量组血清含量为20%。血清作用24 h后，小心吸出孔内液体，每孔体积为100 μL不完全培养基，20 μLMTS染色液，培养箱中孵育1 h后，用酶标仪在450 nm处测定各组吸光度值(OD)。按公式计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率(%)=(1-OD受试药组/OD对照组)×100%。

1.3.4 Annexin V-PE/7-AAD双染法检测含药血清对A549细胞凋亡的影响

将A549细胞消化成单细胞悬液，接种于6孔细胞培养板中，每孔体积为1 mL。在CO2培养箱中孵育24 h。实验设含药血清高、中、低剂量组和空白对照组血清于药物作用24 h后。离心收集胰酶消化后单细胞悬液，用预冷的PBS磷酸盐缓冲液清洗细胞。用1×Binding Buffer缓冲液调节细胞浓度为1×106个/mL。每个样品管中加入100 μL细胞悬液，约1×105个细胞/每管。每管中加入5 μL AnnexinV-PE染料和10 μL 7-AAD染料，轻轻涡旋混匀后，室温避光孵育15 min。最后，每管中加入380 μL预冷的1×Binding Buffer缓冲液后，上机检测细胞凋亡率。

1.3.5 Western-blot法检测含药血清对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

将A549细胞消化为单细胞悬液，接种于100 mm无菌培养皿中，恒温培养24 h。高、中、低剂量组和空白对照组血清于药物作用24 h，离心收集胰酶消化后细胞，加入细胞裂解液，并裂解30 min。低温离心15 000 r/min，10 min，取上清，即为细胞总蛋白。BCA法蛋白定量，加入缓冲液，高温煮沸5 min，蛋白变性后，分装保存。根据蛋白分子量制备分离胶，注入玻璃板内后注入单蒸水隔绝空气。凝胶40 min后，去掉上层单蒸水后注入2 mL 4%浓缩胶，凝胶30 min后，将玻璃板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液后，向各泳道中加入蛋白样品和蛋白Marker后，80 V恒压跑浓缩胶，120 V恒压跑分离胶。蛋白电泳结束后，将切除浓缩胶后的分离胶部分放入转膜缓冲液中。NC膜和滤纸置转膜缓冲液中浸泡后将滤纸、NC膜、凝胶、滤纸放入湿转仪中，200 mA恒流，90 min。将转完蛋白的NC膜染色，观察目的蛋白的转移情况。5%的封闭奶粉或BSA室温封闭3 min。将NC膜放入封闭奶粉稀释一抗中，孵育过夜。加入TBST稀释的二抗，室温孵育2 h。将ECL发光试剂加到NC膜上后，避光反应，Image J软件分析蛋白灰度值。

1.3.6 RT-PCR法检测含药血清对A549细胞凋亡相关基因表达的影响

将处于对数生长期的A549细胞消化成单细胞悬液后，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种于100 mm无菌培养皿中，每皿5 mL，37℃、5%CO2条件下培养24 h。含药血清高、中、低剂量组和空白对照组剂量组血清含量为20%，给药体积为8 mL。药物作用24 h后，小心弃去皿内液体。预冷PBS刮取细胞后，低温离心3 000 r/min，2 min，收集细胞。提取细胞样本中总RNA，取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用DNase Ⅰ试剂盒对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理。用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录，轻轻吸打混匀，37℃孵育50 min，70℃保温10 min。反应结束后的cDNA放置-20℃保存。最后采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

2 结果

2.1 MTT法检测含药血清对A549细胞增殖的影响

观察不同剂量芪杉胶囊含药血清组和空白组对A549细胞增殖作用的影响，结果表明，高、中、低浓度含药血清细胞抑制率分别为24.26%，16.44%和10.89%，芪杉胶囊含药血清浓度越大，对细胞的抑制作用越显著(见表1)。

表1 芪杉胶囊含药血清对A549细胞增殖的影响

注：与空白对照组相比，**P<0.01

2.2 Annexin V-PE/7-AAD双染法检测含药血清对A549细胞凋亡的影响

观察不同剂量芪杉胶囊含药血清组、顺铂组和空白组对A549细胞凋亡的影响，结果表明高、中、低及顺铂组均对细胞凋亡有一定作用，与空白组相比，高、中、低剂量组及顺铂组细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，芪杉胶囊含药血清浓度越大，对细胞凋亡的作用越显著(见表2，图1)。

在凋亡图片中：Annexin V-PE(-)/7-AAD(-)为活细胞；Annexin V-PE(+)/7-AAD(-)为早期凋亡细胞；Annexin V-PE(+)/7-AAD(+)为晚期凋亡细胞；Annexin V-PE(-)/7-AAD(+)为坏死细胞。

表2 芪杉胶囊含药血清对A549细胞凋亡的影响

注：与空白对照组相比，**P<0.01

图1 Annexin V-PE/7-AAD双染法检测含药血清对A549细胞凋亡

2.3 Western-blot法检测含药血清对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

观察不同剂量芪杉胶囊含药血清组、顺铂组及空白组A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果表明芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组Caspase-3的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；芪杉胶囊含药血清高、中剂量组及顺铂组Caspase-9的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组Cytochrome c的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组AKT的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组mTOR的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；芪杉胶囊含药血清高、中剂量组及顺铂组PI3K的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。芪杉胶囊含药血清浓度越大，对A549细胞凋亡相关Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K蛋白表达的影响越显著(见表3、4，图2)。

表3 芪杉胶囊含药血清对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

注：与空白对照组相比，**P<0.01

表4 芪杉胶囊含药血清对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

注：与空白对照组相比，**P<0.01，*P<0.05

图2 Western-blot法检测含药血清对A549细胞凋亡相关蛋白表达

2.4 RT-PCR法检测含药血清对A549细胞凋亡相关基因表达的影响

观察不同剂量芪杉胶囊含药血清组、顺铂组及空白组A549细胞凋亡相关基因表达的影响。结果表明芪杉胶囊含药血清高、中剂量组及顺铂组Caspase-3的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组Caspase-9的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组Cytochrome c的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组AKT的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组mTOR的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组PI3K的相对表达量与空白组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。芪杉胶囊含药血清浓度越大，对A549细胞凋亡相关Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K基因表达的影响越显著(见表5、6)。

表5 含药血清对A549细胞凋亡相关基因表达的影响

注：与空白对照组相比，**P<0.01

表6 含药血清对A549细胞凋亡相关基因表达的影响

注：与空白对照组相比，**P<0.01

3 讨论

PI3K/Akt通路被认为是癌细胞存活的首要通路，有“抗凋亡途径”之称。该信号转导通路的异常，可导致细胞异常增殖引起肿瘤。另外，mTOR是PI3K/Akt的下游靶点，PI3K/Akt信号通路通过磷酸化激活mTOR，调控相关mRNA的转录，调节蛋白的合成，进而影响细胞增殖，从而使肿瘤细胞达到耐药[5]。基于PI3K/Akt信号通路与NSCLC的发病及预后关系密切，针对此信号通路抑制剂的研究也在不断进行。目前，有些PI3K/Akt信号通路抑制剂已经合成，但是这些抑制剂大多毒性剧烈，患者很难耐受，现只能用作生物学研究[6-9]。因此，针对多靶点同时抑制，并且具有低毒性的药物是我们研究寻求的方向。中医药以其稳定的疗效、低毒副反应、多向调节的特点成为我们探究肺癌的治疗方法方向提供了思路。

本研究中，芪杉胶囊中红豆杉、半枝莲、白花蛇舌草等药均有抗癌的物质基础，且多味中药同时调节免疫功能。一方面提示该方确有抗肿瘤研究价值，另一方面，该方具有增强机体免疫力，控制癌细胞扩散，改善症状的作用。正常细胞都具有增殖、分化和凋亡三种特性，一般情况下，三者相互协调，保持平衡，在细胞衰老与更新、保持细胞数目的相对恒定中起着重要作用。细胞凋亡进程受到抑制，细胞的增殖与凋亡失去平衡，导致细胞死亡率下降，则细胞数目不断增加，就会表现出生长优势，这是肿瘤形成的一个重要病理生理基础[10-11]。本实验用不同浓度芪杉胶囊含药血清作用于肺癌A549细胞，均表现为抑制癌细胞增殖的作用，且含药血清浓度越大，对细胞的抑制作用越显著。细胞凋亡本质上是程序性细胞死亡，是由于体内、外环境变化或死亡信号触发，启动自身内部机制，经过多途径的信号传递，导致细胞生命结束[12]。细胞凋亡的异常减少参与肿瘤的发生发展，因此，诱导肿瘤细胞凋亡的策略始终为近年来肿瘤治疗研究的热点和重点。本实验以不同浓度芪杉胶囊的含药血清作用肺癌A549细胞，均对细胞凋亡有一定作用，与空白组相比，芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组细胞凋亡率显著升高，且芪杉胶囊含药血清浓度越大，对细胞凋亡的作用越显著。分别检测不同剂量芪杉胶囊含药血清组、顺铂组及空白组A549细胞凋亡相关Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K蛋白和基因表达的影响。结果显示,芪杉胶囊含药血清高、中、低剂量组及顺铂组蛋白和基因相对表达量与空白组相比，表达量降低；且芪杉胶囊含药血清浓度越大，对A549细胞凋亡相关蛋白和基因表达的影响越显著。

综上所述，芪杉胶囊具有抑制肿瘤的作用，可能通过A549细胞凋亡相关Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K蛋白和基因表达，抑制细胞增值、促进细胞凋亡等途径实现。