穿心莲饮片的特征图谱及主要内酯成分的含量测定*

张峻淞 ，曾令杰 △，崔丹丹 ，黄嘉玲

（1.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006； 2.国家中医药管理局岭南中药材生产与开发重点研究室，广东 广州 510006）

穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees 为爵床科穿心莲属的草本植物，全草入药，主要活性成分有穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯及14-去氧-11，12-二去氢穿心莲内酯（又称脱水穿心莲内酯）等二萜内酯类成分，具有清热解毒、凉血、消肿、燥湿等功效。穿心莲饮片为穿心莲的干燥地上部分，经切段、干燥而成，在干燥、贮藏等过程中，穿心莲内酯类成分的含量会发生降解或转化，导致其质量下降［1-2］。2015年版《中国药典（一部）》仅规定了穿心莲饮片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量［3］，不能全面反映其主要内酯成分的变化情况。穿心莲中除穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯外，还含有较高含量的新穿心莲内酯（达1.615% ）及去氧穿心莲内酯（达 0.76% ）［4-7］。本研究中建立了同时测定穿心莲饮片中穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯含量的高效液相色谱（HPLC）法，并通过特征图谱或指纹图谱来表征上述内酯成分及其他成分的相对比例及变化，以准确反映穿心莲饮片的质量状况及全面表征，并合理评价穿心莲饮片质量的优劣，供其质量标准制订时参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Sartoius型分析天平（德国赛多利斯公司，精度为0.1mg）；AK-100D型超声波清洗器（深圳市洁清洗设备有限公司，功率为200 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

30 批穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees饮片经广东药科大学曾令杰教授鉴定为正品，确认为合格穿心莲饮片样品。样品信息详见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（18∶82，V／V），梯度洗脱，0～60min时18%A→40%A；流速：1.0 mL ／min；进样量：20 μL；检测波长：226 nm；柱温：室温。

2.2 溶液制备

分别取穿心莲内酯对照品、脱水穿心莲内酯对照品、新穿心莲内酯对照品和去氧穿心莲内酯对照品适量，精密称定，置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1 mL含0.1 mg的对照品母液，备用。取样品粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入25 mL 40%甲醇溶液，称定质量；浸泡1 h后，超声处理40 min（功率为200 W，频率为40 kHz）；放冷，称定质量，用40%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10 mL，置中性氧化铝柱（100～200目，5 g，内径为1.5 cm）上，用15 mL 40%甲醇溶液洗脱；收集洗脱液，置25 mL容量瓶中，加40%甲醇溶液至刻度线，摇匀，即得供试品溶液。

表1 穿心莲饮片样品信息

2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下的对照品母液适量，置5 mL容量瓶中，加入甲醇稀释成系列质量浓度的对照品溶液。按拟订色谱条件进样20 μL测定，以混合对照品溶液质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，分别得穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯的回归方程，Y穿＝3×107X穿＋61 423（r＝0.999 2），Y新＝6×106X新＋21 605（r＝0.999 3），Y脱＝4×106X脱＋6 862.5（r＝0.999 4），Y去＝1×107X去＋40 743（r＝0.999 2）。

精密度试验：取2.2项下的对照品溶液，按拟订色谱条件，连续进样6次，测定峰面积。结果4个内酯成分总含量的RSD为 0.43%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（S16）样品粉末 0.5 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，于0，2，4，6，8 h 时测定峰面积。结果 4 个内酯成分总含量的RSD为1.34%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（S16）样品粉末6份，每份0.5 g，精密称定，依法制备供试品溶液，并测定峰面积。结果4个内酯成分总含量的RSD为1.04%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取穿心莲饮片样品（S16）粉末6份，精密称定，分别加入穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯对照品溶液各1 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝6）

2.4 穿心莲饮片特征图谱建立与分析

取不同来源的30批样品粉末0.5 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样20 μL，建立穿心莲饮片的HPLC特征图谱，详见图1。可见，来源不同的穿心莲饮片的HPLC图谱具有共同的鉴别特征，以相似度评价软件计算，其相似度在95%以上。各样品的色谱图中均具有8个明显的色谱峰，可划分为3组，详见图1 A。第Ⅰ组（t为0～22 min，含溶剂峰），以1号峰为主；第Ⅱ组由4个（或以上）色谱峰（t为22～44 min）组成，穿心莲内酯［2（S）］色谱峰的峰高最大；第Ⅲ组由新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯等色谱峰组成（t为 44～60 min），脱水穿心莲内酯色谱峰的峰高最高。由图1 B可见，穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯相对于穿心莲内酯的相对保留时间分别为1.0，1.8，2.0，2.1。

2.5 不同来源样品中4个内酯成分含量测定

由图1 B可见，各批样品中穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯的峰面积，按各回归方程计算4个内酯的含量，详见图2。可见，不同来源的穿心莲饮片中上述4种内酯成分的相对比例及总含量差异较大，有的饮片4个内酯的含量均高或均低，有的是某个（或某几个）内酯含量很低，其他内酯的含量很高。30批样品中，穿心莲内酯的含量为0.16% ～0.51%，新穿心莲内酯的含量为0.13% ～0.34%，脱水穿心莲内酯的含量为0.11% ～0.55%，去氧穿心莲内酯的含量为0.12% ～0.49%，上述4个内酯成分总含量为 0.75% ～1.52%。

图2 不同来源的穿心莲饮片中穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含量及其总含量的变化

3 讨论

穿心莲药材或饮片的指纹图谱或特征图谱能较全面地鉴别及评价其质量［8-16］。为了综合评价不同来源穿心莲饮片的质量，并监控穿心莲饮片加工和储存过程中的质量变化，本研究中建立了同时测定穿心莲饮片的特征图谱及4个主要内酯活性成分的HPLC法。结果表明，来源不同的穿心莲饮片的HPLC特征图谱特征基本一致，其差异为各峰的峰值大小和相对比例。穿心莲饮片的特征图谱中，共有8个主要色谱峰，且均以脱水穿心莲内酯峰面积最大，其次是穿心莲内酯；穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯相对于穿心莲内酯的相对保留时间分别为1.0，1.8，2.0，2.1。

分别考察了不同比例的水-甲醇、水-乙腈、0.4%H3PO4-甲醇、0.4%H3PO4-乙腈、醋酸钠缓冲液（pH 6.4）-甲醇、醋酸钠缓冲液（pH 6.4）-乙腈等的作为流动相的分离效果，最后确定以水-乙腈（82∶18，V／V）梯 度 洗 脱 较 好 。曾 考 察 Agilent，Yilete，Phenomen，Dikma，Diomonsil的 C18色谱柱分别在 15，25，35，45 ℃条件下各色谱峰的分离情况。结果表明，由不同厂家生产的C18色谱柱对穿心莲内酯的分离有一定影响，其中Agilent，Dikma和Yilete的C18色谱柱均能对穿心莲内酯成分实现较好分离，且柱温条件对穿心莲内酯类成分分离的影响不明显，故选择室温作为柱温。

参考2015年版《中国药典（一部）》中穿心莲饮片标准的含量测定方法，增加了新穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯的含量测定方法。同时测定穿心莲饮片中穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯这4个内酯成分的含量，能更全面地把控穿心莲饮片的质量。