尿酸消胶囊微生物限度检查法的建立和验证

石 云，王晓妃

(1.普洱市食品药品检验检测中心质保室，云南 普洱 665000； 2.普洱市食品药品检验检测中心药品微生物室，云南 普洱 665000)

尿酸消胶囊是普洱市民族医院开发研制的新制剂，用于预防及治疗尿酸过高所导致的关节肿痛，临床效果显著。由秦皮、倒心盾翅藤、虎杖和肾茶4味中药制成，具有消炎利尿、祛风胜湿、活血通络和解热止痛的功效，能舒缓关节和肌肉酸痛症状，缓解痛风所致的肿痛。本研究根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)“非无菌产品微生物限度检查”[1]，建立微生物限度检查方法。而秦皮[2]、虎杖[3]和肾茶[4]均有抑菌或抗菌作用，会对微生物限度检查结果的准确性产生影响[5]，因此，必须进行微生物限度检查法的验证，确保所建立的检查方法能够消除供试品的抑菌活性，保证结果准确可靠[6]。参考相关文献资料[7-8]，本研究对尿酸消胶囊微生物限度检查法进行验证，建立适合该制剂的微生物限度检查方法。

1 材料

1.1 仪器

LMQ.C/3 260 J型立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)；101-2型电热鼓风干燥箱(上海崇明实验仪器厂)；SPX-250B-Z型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；BMJ-250型霉菌培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；T500型电子天平(美国双杰兄弟集团有限公司)；YJ-A型电动匀浆仪(浙江省台州市椒江五星机械仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

尿酸消胶囊(普洱市民族医院，规格：每粒装0.35 g，批准文号：滇药制字(Z)20 140 010 J，批号：20160327、20160411和20160425)；氯化钠(分析纯，天津化学试剂厂)。

1.3 标准菌种

枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、铜绿假单孢菌[CMCC(B)10104]、沙门菌[CMCC(B)50094]及黑曲霉[CMCC(F)98003]均来源于中国食品药品检定研究院。

1.4 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、肠道菌增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基及4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基均购自北京三药科技开发公司。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠埃希菌和沙门菌的胰酪大豆胨琼脂培养基的新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液分别稀释至105～107，制成适宜浓度的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物，加入至0.9%无菌氯化钠溶液5 ml中，将孢子洗脱，采用适宜的方法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液，备用[9]。

2.2 需氧菌总数计数方法适用性试验

2.2.1 供试液的制备：取供试品10 g，加入45 ℃、pH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，匀浆仪混匀，制成1∶10供试液，取1∶10供试液10 ml，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90 ml，摇匀，制成1∶100供试液，备用。

2.2.2 试验组：(1)平皿法。取1∶100供试液20 ml，加入制备好的各菌悬液0.2 ml，混匀，使每1 ml供试液中含菌数≤100 cfu，取该供试液1 ml注入平皿，立即倾注45 ℃胰酪大豆胨琼脂培养基；33 ℃下培养24～72 h，每日观察并记录(n=2)。(2)薄膜过滤法。取1∶100供试液1 ml加入到滤器中，用pH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 ml，在最后1次冲洗液中加入≤100 cfu的试验菌，将滤

膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，33 ℃培养24～72 h，每日观察并记录(n=2)。

2.2.3 菌液组：取pH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替 1∶100供试液，按照“2.2.2”项下平皿法制备菌液组供试液，使每1 ml供试液中含菌数≤100 cfu，按照“2.2.2”项下平皿法和薄膜过滤法测定所加的试验菌数(n=2)。

2.2.4 供试品对照组：取1∶100供试液10 ml，加入pH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.1 ml，混匀，按照“2.2.2”项下平皿法和薄膜过滤法测定供试品菌数(n=2)。

2.3 霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

2.3.1 试验组：(1)平皿法。取1∶10供试液20 ml，加入制备好的各菌悬液0.2 ml，混匀，使每1 ml 供试液中含菌数≤100 cfu，取该供试1 ml注入平皿，立即倾注45 ℃沙氏葡萄糖琼脂培养基；23 ℃培养24～120 h，每日观察并记录(n=2)。(2)薄膜过滤法。取1∶10供试液1 ml加入到滤器中，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 ml，在最后1次冲洗液中加入≤100 cfu的试验菌，将滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，23 ℃培养24～120 h，每日观察并记录(n=2)。

2.3.2 菌液组：取相应稀释液代替1∶10供试液，按照“2.3.1”项下平皿法制备菌液组供试液，使每1 ml供试液中含菌数≤100 cfu，再按“2.3.1”项下平皿法和薄膜过滤法测定所加的试验菌数(n=2)。

2.3.3 供试品对照组：取1∶10供试液10 ml，加入0.1 ml相应的稀释液，混匀，按照“2.3.1”项下平皿法和薄膜过滤法测定供试品菌数(n=2)。

2.4 需氧菌总数计数方法、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验回收率

试验菌株的回收率=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数，结果见表1。从表中可知，需氧菌总数计数采用平皿法时，试验菌株(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌)的回收率<0.5；采用薄膜过滤法时，试验菌株的回收率≥0.8；霉菌和酵母菌总数计数采用平皿法时，试验菌株(白色念珠菌、黑曲霉)的回收率≥0.5，采用薄膜过滤法时，试验菌株的回收率≥0.8。需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数采用薄膜过滤法时回收率均在0.5～2.0范围内，符合《中华人民共和国药典》(2015年版)的规定[10]。

2.5 控制菌检查方法适用性试验

2.5.1 耐胆盐革兰阴性菌：(1)供试液制备。取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基100 ml，匀浆混匀，在23 ℃培养2 h，备用。(2)试验组。取供试液10 ml及<100 cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，分别接种至肠道菌增菌液体培养基100 ml中，混匀，33 ℃培养48 h后,划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，33 ℃培养24 h，观察平板菌落生长情况。(3)阳性对照组。取稀释液10 ml及<100 cfu的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，分别接种至肠道菌增菌液体培养基100 ml中，按照本项下试验组方法操作。(4)阴性对照组。取稀释液10 ml接种至肠道菌增菌液体培养基100 ml中，按照本项下试验组方法操作。试验结果见表2。

表2 耐胆盐革兰阴性菌检查方法适用性试验结果Tab 2 Results of the applicability test of the test method for gallbladder salt gram-negative bacteria

注：“+”表示有菌生长或阳性反应；“-”表示无菌生长或阴性反应

Note:“+” indicates the bacterial growth or positive reaction; “-” means the sterile growth or negative reaction

2.5.2 大肠埃希菌：(1)供试液制备。取“2.2.1”项下1∶10供试品液10 ml，加胰酪大豆胨液体培养基100 ml，混匀，在33 ℃培养24 h。(2)试验组。取培养后的供试液1 ml及<100 cfu的大肠埃希菌，接种至麦康凯液体培养基100 ml中，混匀，43 ℃培养48 h，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，33 ℃培养18～72 h，每日观察平板菌落生长情况，挑取典型菌落接种至4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基中，33 ℃培养24 h，在366 nm紫外光下观察，同时用未接种的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基作本底对照，然后沿管壁加入数滴靛基质试液，观察液面是否呈玫瑰红色。(3)阳性对照组。取稀释液1 ml及<100 cfu的大肠埃希菌，接种至麦康凯液体培养基100 ml中，按照本项下试验组方法操作。(4)阴性对照组。取稀释液1 ml，接种至麦康凯液体培养基100 ml中，按照本项下试验组方法操作。试验结果见表3。

表3 大肠埃希菌检查方法适用性试验结果Tab 3 Results of applicability test of Escherichia coli test method

注：“+”表示有菌生长或阳性反应；“-”表示无菌生长或阴性反应

Note:“+” indicates the bacterial growth or positive reaction; “-” means the sterile growth or negative reaction

2.5.3 沙门菌：(1)供试液制备。取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基200 ml，匀浆混匀，在33 ℃培养24 h，备用。(2)试验组。取供试液0.1 ml及<100 cfu的沙门菌，接种至RV沙门增菌液体培养基10 ml中，混匀，33 ℃培养24 h，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上，33 ℃培养48 h，挑取典型菌落接种于三糖铁琼脂培养基高层斜面，观察斜面颜色变化。(3)阳性对照组。取稀释液0.1 ml及<100 cfu的沙门菌，接种至RV沙门增菌液体培养基10 ml中，按照本项下试验组方法操作。(4)阴性对照组。取稀释液0.1 ml，接种至RV沙门增菌液体培养基10 ml中，按照本项下试验组方法操作。试验结果见表4。

上述结果显示，采用常规方法即可检出所加试验菌相应的反应特征。

3 讨论

本研究结果显示，尿酸消胶囊进行微生物限度检查时，需氧菌总数计数方法应采用薄膜过滤法，霉菌和酵母菌总数计数方法可采用平皿法和薄膜过滤法，但应优先选用薄膜过滤法。

表4 沙门菌检查方法适用性试验结果Tab 4 Results of applicability test of salmonella test method

注：“+”表示有菌生长或阳性反应；“-”表示无菌生长或阴性反应

Note:“+” indicates the bacterial growth or positive reaction; “-” means the sterile growth or negative reaction

控制菌检查可采用常规方法。

通过验证试验发现，尿酸消胶囊虽含有一定的抑菌药成分，但为选择性抑菌，采取适宜的检查方法，可消除样品抑菌活性对实验结果的影响。尿酸消胶囊为中药复方制剂，微生物限度检查是保证其质量的重要指标，可通过方法适用性试验，建立适合于本品的检验方法，保证患者用药安全。本品含药材原粉，需氧菌总数微生物限度标准为104cfu/g，故选取1∶100供试液进行方法验证试验[11]。

《中华人民共和国药典》(2010年版)计数方法适用性试验采用的是大肠埃希菌，且沙门菌检查仅对含动物组织及动物类原药材粉的口服制剂；而《中华人民共和国药典》(2015年版)“非无菌产品微生物限度检查”中，计数方法适用性试验采用铜绿假单胞菌菌替代了大肠埃希菌，且扩大了检查的种类及范围，药品质量标准得到了有效提高[12-13]。