云南维西县百花蜜17种游离氨基酸的测定

韩加敏 陈梦迪 董霞 刘意秋 匡海鸥 卢云飞 褚卫兵 董坤

（1 云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；2 云南农业大学食品科技学院，昆明 650201；3 迪庆哈达谷蜂业发展有限责任公司，迪庆 674400）

1 前言

维西百花蜜是由东方蜜蜂采自高寒森林多种蜜源植物的花蜜与自身分泌物混合后，经充分酿制而成的成熟蜂蜜。云南省迪庆藏族自治州维西傈僳族自治县地处世界自然遗产“三江并流”腹地，地势大起大落，由南往北呈阶梯状台升，独特的地理位置使其境内蜜源植物极为丰富，所产蜂蜜源自野生蜜源，其中许多花卉是药材之花，又出产在1800～3000m高原之上，故当地蜂农称之为药材蜜或高原百花蜜[1]。维西百花蜜色泽呈琥珀色或深琥珀色，常温时呈粘稠流体状，有典型的自然花香气息，口感浓厚、余味清香悠久，属蜜中珍品。国家质检总局发布了2015年第44号公告，批准维西百花蜜成为迪庆州第一个获得国家地理标志保护的产品。据统计，截至2015年，维西县养蜂户已达3000余户，蜂蜜产量约200t，成为当地农民增收的一个主渠道之一[2]。

我国有100多种主要蜜源植物，蜂蜜种类繁多，蜂蜜中氨基酸的主要来源是蜜源植物的花粉、花蜜及蜜蜂自身的分泌物，其种类和含量受蜜源植物影响，也与地理环境和气候等因素有关。氨基酸是蛋白质的基本组成单元，是人体所必需的一种物质，也是食品营养价值评价的重要指标[3]。蛋白质在人体中有着重要的生理功能，维持组织细胞的生长、更新和修补，为机体提供能量，还可以转变为一些生理活性分子，大分子如激素、酶类、抗体等，小分子如儿茶酚胺类激素、嘌呤、嘧啶和卟啉等，对动物的代谢活动发挥不可替代的作用。游离氨基酸是以游离状态存在的一种小分子化合物，结构上包含氨基和羧基。氨基酸可以分为蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸两大类。当体内缺乏蛋白质氨基酸时，会导致组织器官代谢紊乱，引发一系列的相关疾病[3,4]。至少有8种氨基酸不能在人体中合成或合成量不足，得由食物来提供这一类氨基酸，这就是所说的必需氨基酸。所以，测定维西百花蜜的游离氨基酸对评价它的营养价值有重要作用。目前，国内对于单花蜜研究很多，但对于多花蜜中游离氨基酸的研究还比较少。本研究通过测定维西百花蜂蜜中的游离氨基酸，评价维西百花蜂蜜的质量和营养价值以及为百花蜂蜜的研究提供真实的科学依据，为当地更好的开发蜂产品提供一定的帮助。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 实验材料

维西苦味百花蜜（迪庆藏族自治州维西县塔城镇，2015年9月采）；维西甜味百花蜜（迪庆藏族自治州维西县中路乡，2015年9月采）。

2.1.2 实验试剂

甲醇、乙腈、蒸馏水、醋酸钠、β-硫基乙醇、邻苯二甲醛（OPA）、0.4mol/l pH 9.4的硼酸盐缓冲液、17种氨基酸混标（溶液）及17种氨基酸单标（中国计量科学院）等。

2.2 仪器与设备

循环水式真空泵、抽滤瓶、超声清洗仪、电子天平（AX223ZHE，常州奥豪斯仪器有限公司）、离心机（TDL奥豪斯仪，上海安亭科学仪器厂）、高效液相色谱仪（Agilent 1260 LC FLD-G1321B）、0.45滤膜（水系、有机系）、移液枪、pH计等。

2.3 实验步骤

（1） 样液制备：准确称取蜜样5g（精确到0.01g）于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移至50ml容量瓶并定容，4℃保存备用。

（2）流动相配制：流动相A：20mmol/l醋酸钠pH=7.2，准确称取1.64g醋酸钠溶于1000ml蒸馏水中，用2%的醋酸调节pH至7.2，然后用真空泵抽滤，超声振动20min；流动相B：甲醇∶乙腈∶pH=7.2的20mmol/l醋酸钠=40∶40∶20，按上述比例混匀后用真空泵抽滤，超声振动20min。

（3）OPA衍生试剂的配制：准确称取10mg OPA加入0.2ml甲醇溶液中，然后加入40μl β-硫基乙醇，最后加入2ml 0.4mol/l pH 9.4的硼酸盐缓冲液，配好的试剂密封避光保存。

（4）色谱条件：Agilent1260，FLD（G1321B）；色谱柱：ZORBAX Eclipse AAA，Analytical 4.6×150nm 5-Micron；流动相流速：1.4ml/min；进样量：7μl。

（5）17种氨基酸混标根据上述条件进样，测定17种氨基酸混样色谱图。17种氨基酸单标配制成浓度和对应的混标浓度一致的溶液，然后根据上述色谱条件装瓶上机，分析出每种氨基酸的停留时间，确定17种混标种每种氨基酸的位置。待测样液用0.45μm滤膜过滤后装瓶上机，根据上述色谱条件检测花蜜中氨基酸的种类，用外标法计算每种氨基酸的含量。

3 结果与讨论

3.1 游离氨基酸的测定结果

3.1.1 游离氨基酸混标及蜜样色谱图

17种氨基酸混标（天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸）及蜂蜜样品的色谱图如下图1所示。

图1 17种氨基酸混标及蜂蜜样品色谱图

3.1.2 游离氨基酸的种类及保留时间

表1 蜂蜜样品中游离氨基酸种类、保留时间及含量

2个维西百花蜜样品的游离氨基酸的种类、含量以及在测定过程中的保留时间如表1所示。实验中测得苦味百花蜜含有17种氨基酸，天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、色氨酸，甜味百花蜜含有16种氨基酸，不含有苏氨酸。这2个蜂蜜样品中维西苦味百花蜜的总游离氨基酸含量较高，为960.58μg/g，维西甜味百花蜜总含量为708.89μg/g。2个蜜样中含量最高的氨基酸均不相同，苦味百花蜜中组氨酸含量最高，为197.43μg/g，占游离氨基酸总含量的20.55%；甜味百花蜜中丝氨酸含量最高，为263.16μg/g，占游离氨基酸总含量的37.12%。所测得的游离氨基酸中含有人类所需的所有必需氨基酸，蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸。

3.1.3 百花蜜中含量差异较大的几种游离氨基酸

在维西东方蜜蜂百花蜜中，对4种含量较高的氨基酸，即谷氨酸、丝氨酸、组氨酸和苯丙氨酸来说，苦味百花蜜的组氨酸和苯丙氨酸含量较高，分别为197.43μg/g和171.47μg/g，而在甜味百花蜜中这2种氨基酸的含量很低，组氨酸几乎是甜味百花蜜含量的10倍，苯丙氨酸是甜味百花蜜的7.5倍。谷氨酸虽然含量不突出，但也比甜味百花蜜高出近10倍。但是，在甜味百花蜜中丝氨酸含量远远高于苦味百花蜜，也是此次所测得的游离氨基酸中含量最高的。

3.1.4 百花蜜中含有的必需氨基酸及含量

至少有8种氨基酸不能在人体中合成或合成量不足，得由食物来提供这一类氨基酸，这就是所说的必需氨基酸，维西百花蜜中含有这8种必需氨基酸。如图3所示，苦味百花蜜中含有人类所需的8种必需氨基酸，且7种氨基酸含量都普遍在20μg/g以上，尤其是苯丙氨酸，含量高达171.47μg/g。甜味百花蜜中含有7种必需氨基酸，不含苏氨酸。而且，相对于苦味百花蜜来说，甜味百花蜜中的必需氨基酸的含量相对较低。

图2 蜂蜜样品中含量差异较大的游离氨基酸

图3 蜂蜜样品中含有的必需氨基酸及含量

3.2 讨论

本研究采用液相色谱法测定游离氨基酸，在维西百花蜜中发现17种游离氨基酸存在；与赵成仕[5]等人所采用的酸水解-全自动氨基酸分析仪测定蜂蜜中17种氨基酸相比，其所测的蜂蜜中色氨酸未测，而维西百花蜜中丙氨酸未测；在其研究中，含量比较高的是精氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，而本研究中，含量较高的是谷氨酸、丝氨酸、组氨酸和苯丙氨酸。刘小力[6]测定了洋槐蜜、苜蓿蜜和枣花蜜中氨基酸组成及含量，其所测的3种蜂蜜均含丙氨酸，但不含色氨酸，含量较高的是天门冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸。由于以上研究所测含量均为百分比含量，与本研究所测的氨基酸不能做定量比较。周贤靖[7]等人用毛细管电泳-间接紫外检测法测定单花蜜中的氨基酸仅9种，且5个样品均未检测到甲硫氨酸即蛋氨酸，在本研究中维西百花蜜所测得的蛋氨酸的含量分别为37.28μg/g和40.15μg/g；周贤靖所测的单花蜜和我们所测的维西百花蜜中的谷氨酸和丝氨酸含量均高，但其所测的单花蜜中脯氨酸、天冬氨酸含量较高，而维西百花蜜中组氨酸和苯丙氨酸含量较高。

谷氨酸可以增强食品风味；丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用；在营养学范畴里，组氨酸被认为是一种人类（主要是儿童）必需的氨基酸；苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一，在体内大部分经苯丙氨酸羟化酶催化作用氧化成酪氨酸，并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素，参与机体糖代谢和脂肪代谢[8]；苏氨酸是一种重要的营养强化剂，有缓解人体疲劳、促进生长发育的效果。维西百花蜜中，含有人体所需的8种必需氨基酸，因此从氨基酸方面来看，该地区蜂蜜的营养价值较高，且苦味百花蜜优于甜味百花蜜。尽管2种维西百花蜜的氨基酸组成及含量存在差异，但对苦味蜂蜜的形成机制尚不清楚。

4 结论

维西县甜味和苦味百花蜜均含有以下16种游离氨基酸，分别为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸，其中苦味百花蜜除此之外还含有苏氨酸。在维西东方蜜蜂百花蜜中，4种含量较高的氨基酸分别是谷氨酸、丝氨酸、组氨酸和苯丙氨酸；在维西苦味蜜中，组氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸含量较高。必需氨基酸是人体自身不能合成的一类氨基酸，维西百花蜜含有人体所需的全部必需氨基酸，说明该地区蜂蜜在氨基酸方面的营养价值较高。