超高效液相色谱-串联质谱法检测猪肌肉组织中烯丙孕素残留

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(1 .北京市兽药监察所，北京 102600；2.首都师范大学化学系，北京 100048)

烯丙孕素是一种人工合成的甾类促孕激素[1，2]，化学结构式见图1。烯丙孕素可抑制促性腺激素的释放[3]，降低其在血浆中的浓度发挥药理活性，畜牧业中常用烯丙孕素使动物同步发情进行繁育[4-6]。长期食用含有烯丙孕素药物的肉制品会影响机体内激素平衡，诱发癌变，导致幼儿发育异常等[7]。目前很多国家已对食物中烯丙孕素残留限量做出严格的规定和要求[8]，如日本规定鳗鱼中烯丙孕素的最高残留限量为3.0μg/kg，欧盟严格限制乙酰孕激素在动物生长中的使用。我国尚未批准该药用于兽医临床。

图1 烯丙孕素化学结构式

国外报道有关烯丙孕素残留的检测方法主要有酶联免疫法[9]、液相色谱法[10]、气相色谱-串联质谱法[11]、液相色谱-串联质谱法[12-14]等。酶联免疫法具有较高灵敏度，但易出现假阳性；液相色谱法抗干扰能力差且灵敏度低，易受基质中结构相似化合物的干扰；气相色谱法样品衍生化前处理繁琐等。国内关于烯丙孕素残留检测的报道很少，超高效液相色谱-串联质谱法具有快速，灵敏度高，重现性好等优点，将是未来烯丙孕素残留检测的发展方向。

本实验建立了猪肌肉组织中烯丙孕素残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法，该方法快速、准确、灵敏度高，满足国内外法规中关于烯丙孕素残留定性定量分析。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1仪器

超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)；电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；高速冷冻离心机(日本HITACHI 公司)；氮吹仪(Organomation Associates 公司)；旋涡混合仪(德国IKA公司)。

1.1.2试剂

烯丙孕素标准品购自德国Dr公司，纯度≥99.0%；乙腈、甲醇，色谱纯，甲酸，质谱级，均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；乙酸乙酯，分析纯，购自北京化工试剂厂。其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1样品前处理

取猪肌肉组织样本2g±0.01g于50mL离心管中，12000r/min高速匀浆2min，加入5mL乙腈+乙酸乙酯(V/V,3∶2)提取液，涡旋混匀5min，离心10min(4℃，10000r/min)，5mL提取液重复提取1次，将两次提取上清液合并于15mL离心管中，置于-20℃冰箱，冷冻30min，快速转移至预冷的离心机，离心5min(4℃，10000r/min)，弃去脂肪层，转移溶液至15mL离心管，40℃水浴氮吹至干，残余物用1mL20%乙腈水溶液复溶，上清液过0.22μm滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.2液相色谱参考条件

液相色谱条件：C18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸水；流速：0.3mL/min，梯度洗脱参数见表1；进样量：5μL；柱温：室温。

表1 烯丙孕素超高效液相色谱梯度洗脱条件

1.2.3 质谱参考条件

离子源：电喷雾(ESI)离子源；检测方式：多反应监测(MRM)；扫描方式：正离子扫描；电离电压：3.0 kV；源温：150℃；雾化温度：450℃；锥孔气流速：150 L/h；雾化气流速：800 L/h。质谱参考条件见表2。

表2 烯丙孕素定性定量离子对、锥孔电压和碰撞能量

1.2.4 基质匹配标准曲线的制备

准确称取适量烯丙孕素标准品，用甲醇溶解配制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液，在空白基质中添加适量的标准工作液配制成5个不同浓度(1、5、10、25、50 ng/mL)，以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化

烯丙孕素常用提取试剂有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂。考虑到提取过程中杂质干扰和回收率测定，本实验选用乙酸乙酯和乙腈作为提取液提取效果较优。

样品中杂质主要为蛋白质、脂类及极性小分子成分，蛋白质和极性小分子可通过有机试剂去除[15]。脂类对检测响应有较大干扰作用，常用去脂方法有加入正己烷萃取或采用冷冻脱脂，采用正己烷脱脂会导致提取液乙腈层的部分损失, 从而影响结果准确性。相关研究指出[16]，采用低温冷冻方法去除脂类其效果可满足检测要求。

2.2 色谱条件优化

采用C18反相色谱柱可使烯丙孕素药物较好分离，本研究结果表明柱长50 mm，柱内径2.1 mm, 粒度1.7 μm，C18反相色谱柱对烯丙孕素分离效果最好。以乙腈-0.1%甲酸水作为流动相梯度洗脱，进样量5 μL，流速0.3 mL/min。结果表明乙腈-0.1%甲酸水做流动相对烯丙孕素有良好的色谱分离效果，可兼顾质谱响应，色谱峰峰形较优。

2.3 质谱条件优化

不同药物对流动相、流速、色谱柱等的响应和灵敏度不同，甚至会出现离子抑制或者增强效应，需考虑所测药物化学结构，以达到满意的效果。在正离子检测方式下，选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性离子，对各参数进行优化，烯丙孕素标准品(MRM)色谱图如图2。

图2 烯丙孕素标准品(MRM)色谱图(4.0 ng/mL)

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围

在选择色谱条件下，添加适量标准工作液配制浓度1、5、10、25、50 ng/mL基质匹配溶液，烯丙孕素在猪肌肉基质中标准曲线见图3。

结果表明，在1～50 ng/mL浓度范围内烯丙孕素色谱峰面积与浓度呈良好线性相关，回归方程：Y= 29146X+47967，相关系数R2为0.9969。

图3 烯丙孕素在猪肌肉基质中标准曲线

2.4.2 检测方法灵敏度

方法检测限(LOD)和定量限(LOQ)：按照药物选择离子响应色谱峰信噪比S/N>3(按PtP算)确定检测限；按照药物选择离子响应色谱峰的信噪比S/N>10(按PtP算)确定定量限。

添加适量标准溶液于2 g空白试样中，分别制备得到0.3 μg/kg和1.0 μg/kg的添加样品，按检测步骤处理样品、检测。结果表明，烯丙孕素检测限(LOD)为0.3 μg/kg，定量限(LOQ)为1.0 μg/kg。

2.4.3 检测方法准确度和精密度

选取空白样品进行空白添加实验，验证该方法的准确度和精密度，猪肌肉组织添加和空白中烯丙孕素MRM色谱图见图4和图5。添加浓度为1.0、2.0、10.0 μg/kg，每个浓度设5个平行，连续做3天，计算添加回收率、日内变异系数和日间变异系数。在3个浓度添加水平下，平均回收率范围为68.5%～87.9%；日内变异系数1.1%～6.0%，日间变异系数5.5 %～10.7%，方法回收率及精密度满足残留检测要求，检测方法准确度及精密度结果见表3。

表3 猪肌肉组织中烯丙孕素添加回收率和变异系数(n=5)

图4 空白猪肌肉组织烯丙孕素MRM色谱图

图5 烯丙孕素猪肌肉组织添加MRM色谱图(2.0 μg/kg)

3 结论

本研究采用超高效液相色谱-串联质谱技术建立了猪肌肉组织中烯丙孕素残留的快速检测方法，对提取试剂、液相色谱、质谱条件等进行了优化，并进行了方法学考察。结果表明，该方法快速、简便，灵敏度高，重现性好，回收率满足残留检测要求；适用猪肌肉组织中烯丙孕素残留检测的要求。