烯丙孕素缓释微球的制备及特性研究

陈沃俊,张志远,邓翔云,张妙齐,曾蔼宁,冼伟杭,陈胜锋,陈志胜,计慧琴,刘璨颖,张 晖,白银山,王丙云

(佛山科学技术学院 生命科学与工程学院,广东佛山 528000)

母猪批次化生产管理是现代集约化养殖的关键,通过人为控制,实现对猪群繁育过程的同步管理,使同一批次的母猪同期发情、同期排卵、同期配种、同期妊娠以及同期分娩。烯丙孕素(altrenogest)是母猪批次化生产管理中同步发情环节的关键药物,是一种人工合成的21碳甾体类孕激素[1-2]。烯丙孕素的作用机理与天然黄体酮相似,给药期间能抑制脑垂体分泌促性腺激素,从而阻止卵泡发育以及母猪发情。停药后,脑垂体恢复促性腺激素的分泌,母猪恢复发情和卵泡发育[3-5]。由于其水溶性差,生物利用度低,因此需要频繁给药以维持有效药物浓度,在临床应用时通常以20 mg/d的剂量连续给药18 d,给猪场添加了许多工作量。

微球(microsphere)作为药物载体的研究始于20世纪70年代中期,具有靶向性、缓释长效性以及能掩盖药物不良气味等优点,是一种良好的药物载体[6]。用于制备微球的包材种类繁多,其中单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物(polyethylene glycol monomethyl ether-polylactic acid,mPEG-PLA)具有良好的生物相容性和可生物降解性,最终可完全降解为CO2和H2O排出体外,不会在动物体内积聚产生毒副作用,是一种新型控制药物释放的载体材料[7]。mPEG-PLA是FDA批准的一类药物辅料,已广泛用于生物医学,特别是药物输送系统领域,在临床上取得了较好效果[8]。另外,以mPEG-PLA作为载体材料制备的微粒制剂具有良好的缓释性能,Zhang等使用乳化-溶剂挥发法制备三七总皂苷/mPEG-PLA微球,经体外释放试验证明三七总皂苷/mPEG-PLA微球稳定、长效释放24 d,并能在60 d内降解[9]。

本试验拟采用mPEG-PLA为载体材料,通过乳化-溶剂挥发法制备烯丙孕素缓释微球,达到烯丙孕素在母猪体内缓慢长效释放、提高其生物利用度、减少临床给药次数和降低养殖成本的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 烯丙孕素原料药,纯度为98%,上海源叶生物科技有限公司产品;烯丙孕素对照品(批号160415),纯度99%以上,购自中国兽医药品标准物质订购平台。

1.1.2 主要试剂 mPEG2000-PLLA10000,相对分子质量约为12 000,下文统称mPEG-PLA,济南岱罡生物工程有限公司产品;明胶、吐温-80,均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品;二氯甲烷,天津市大茂化学试剂厂产品;无水乙醇,天津市百世化工有限公司产品;乙腈,美国天地有限公司产品。乙腈为色谱纯,其余药品与试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器 电动恒速搅拌器(LC-OES-60SH),购自上海力辰邦西仪器科技有限公司;电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品;台式离心机(TG16-WS),湖南湘仪离心机仪器有限公司产品;真空冷冻干燥机(德国Cheist Alpha 1-4 LSC),购自Marin Christ公司;RC-6溶出度测定仪,天津天光光学仪器有限公司产品;LC-15C高效液相色谱仪,日本岛津公司产品;马尔文激光粒度仪Mastersizer3000,英国马尔文帕纳科公司产品;综合药物稳定性试验箱(WYH-100Z),购自杭州旌斐仪器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 烯丙孕素缓释微球的制备及工艺优选 制备方法:采用乳化-溶剂挥发法制备烯丙孕素缓释微球。烯丙孕素缓释微球制备的全过程需要在避光条件下进行。将适量的烯丙孕素和mPEG-PLA溶解于二氯甲烷,作为油相;将适量明胶和吐温-80溶解于纯水,作为水相。将水相缓慢加入到处于持续搅拌状态的油相中,形成O/W型乳剂,在常温下搅拌至二氯甲烷全部挥发。收集二氯甲烷挥发完全后的产物,4 000 r/min离心10 min后,用纯水洗涤3次,离心收集洗涤后的产物,真空冷冻干燥后即得烯丙孕素缓释微球。

制备工艺优选:在单因素试验的基础上,挑选出对烯丙孕素制备影响较大的5个因素(搅拌速度、水相中吐温-80含量、mPEG-PLA质量浓度、油水体积比、水相中明胶含量),每个因素设置5个水平进行正交试验设计,表1为正交试验因素与水平表。使用SPSS 17.0设计L25(55)正交表,并以包封率为评价指标,筛选烯丙孕素缓释微球的最佳制备条件。

表1 正交试验设计因素与水平

1.2.2 烯丙孕素标准曲线的绘制 高效液相色谱条件:Ecosil C18色谱柱(5 μm,4.6×250 mm,120ACUXE),其余色谱条件参考黄忠等烯丙孕素含量测定的色谱条件[10]。

标准曲线的建立:精密称取10 mg的烯丙孕素对照品,用无水乙醇溶解并稀释,配制成3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的烯丙孕素对照品工作液,用0.22 μm的有机系针筒式过滤器过膜后,按照上述的色谱条件进行分析。以色谱峰面积为纵坐标,以烯丙孕素对照品浓度为横坐标进行线性回归,得到标准曲线图和线性回归方程。

1.2.3 包封率和载药量的测定 准确称取10 mg烯丙孕素缓释微球于10 mL棕色容量瓶中,加入1 mL二氯甲烷并在30℃的条件下超声15 min后,加入无水乙醇定容。用0.22 μm的有机系针筒式过滤器过膜后,按照1.2.2所述的色谱条件进样分析。载药量和包封率计算公式如下:

载药量(%)=提取液药物浓度×提取液总体积/烯丙孕素缓释微球质量(10 mg)

包封率(%)=载药量×烯丙孕素缓释微球总质量/烯丙孕素投药量

1.2.4 烯丙孕素缓释微球形态观察与粒径测定 参考李希凯等[11]微球形态观察的扫描电镜条件,并使用马尔文激光粒度仪Mastersizer3000测定烯丙孕素缓释微球的平均粒径,并记录粒径分布图。

1.2.5 烯丙孕素缓释微球的体外释放试验及体外释放曲线方程拟合 溶出度测定方法按照《中国兽药典》2015版溶出度测定法第二法浆法,溶出介质分别为含1%吐温-80 pH 1.2的盐酸缓冲溶液、含1%吐温-80 pH 4.1的乙酸缓冲溶液以及含1%吐温-80 pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液各900 mL,溶出温度为37℃±0.5℃,转速100 r/min,烯丙孕素缓释微球的添加质量为1 000 mg,分别于0.25、0.5、1、2、3、4 h取样1 mL,并迅速向溶出杯内添加相同体积相同温度的溶出介质,使用高效液相色谱法测定样品中烯丙孕素的药物浓度,并换算成累计释药量,绘制体外释放曲线。

体外释放曲线方程拟合:以时间t为横坐标,累计释药量M为纵坐标,按照固定的公式,使用Origin 2018拟合成零级释放方程、一级释放方程以及Higuchi方程。

1.2.6 烯丙孕素缓释微球的药物稳定性影响因素试验

1.2.6.1 高温试验 将烯丙孕素缓释微球装于棕色西林瓶中,开口放置于60℃下10 d,于第5天和第10天取样,考察烯丙孕素缓释微球性状以及烯丙孕素含量的变化。

1.2.6.2 高湿试验 将烯丙孕素缓释微球装于棕色西林瓶中,开口放置于25℃,相对湿度90%±5%的条件下10 d,于第5天和第10天取样,考察烯丙孕素缓释微球性状以及烯丙孕素含量的变化,同时准确称取试验前后烯丙孕素缓释微球的重量,计算烯丙孕素缓释微球样品的吸湿增重,以考察烯丙孕素缓释微球的吸湿潮解性能。

1.2.6.3 强光照射试验 将烯丙孕素缓释微球装于棕色西林瓶中,开口放置于照度为4500 lx±500 lx的光照装置中10 d,于第5天和第10天取样,考察烯丙孕素缓释微球性状以及烯丙孕素含量的变化。

2 结果

2.1 烯丙孕素标准曲线的建立

由图1可知,在3.125～100 μg/mL范围内,烯丙孕素浓度与峰面积的线性回归方程为y=28 067x+23 350,R2=0.999 7,线性关系良好,符合检测要求。

图1 烯丙孕素标准曲线

a.烯丙孕素;b.空白微球;c.空白微球表面;d.烯丙孕素缓释微球;e.烯丙孕素缓释微球表面

2.2 烯丙孕素缓释微球的制备工艺优选

正交试验结果表明,烯丙孕素缓释微球的最佳制备工艺为A4B1C4D5E1,即搅拌速度1 000 r/min,吐温-80含量0.2%,mPEG-PLA质量浓度0.07 g/mL,油水体积比0.6,水相中明胶含量1.0%。根据正交试验得到的最佳制备条件制备3批烯丙孕素缓释微球并测定它们的包封率和载药量,最佳制备条件下,烯丙孕素缓释微球的平均包封率为(95.64±0.23)%(n=3),平均载药量为(9.83±0.61)%(n=3),mPEG-PLA对烯丙孕素的包埋效果达到最佳。

2.3 微球的形态观察及粒径分析

扫描电镜结果显示,烯丙孕素原药呈晶体状,空白微球与烯丙孕素缓释微球呈球形,空白微球表面有裂纹,而烯丙孕素缓释微球成球性较好,外观圆整。与空白微球相比,烯丙孕素缓释微球表面呈绒毛状,可能为吸附于微球表面的药物,且烯丙孕素缓释微球表面具有许多微孔。

烯丙孕素缓释微球的粒径分布图如图3所示,烯丙孕素缓释微球的大小主要分布于20～180 μm范围内,平均粒径为82.3 μm。

图3 烯丙孕素缓释微球的粒径分布图

2.4 烯丙孕素缓释微球的体外释放及释放曲线方程拟合

由图4可知,烯丙孕素缓释微球能分别在含有1%吐温-80 pH为1.2的盐酸缓冲液、含有1%吐温-80 pH为4.1的醋酸缓冲液以及含有1%吐温-80 pH为6.8的磷酸盐缓冲液中持续释放4 h以上,4 h内烯丙孕素缓释微球在3种不同pH的释放介质中的累计释药量分别达82.37%、92.80%、96.10%。烯丙孕素缓释微球在1 h内释药较快,而1 h后,烯丙孕素缓释微球的释药速度减慢,且在pH 1.2的盐酸缓冲液中的释放量低于另外两种溶出介质。

图4 不同释放介质下烯丙孕素缓释微球的体外释放曲线(n=3)

烯丙孕素缓释微球的体外释放曲线方程拟合结果如表3所示,可以明显看出,烯丙孕素缓释微球在3种不同pH的溶出介质中的溶出曲线更符合一级释放模型,拟合效果最佳,而与零级释放方程以及Higuchi方程的拟合效果较差。所以,烯丙孕素缓释微球的释放机理符合一级动力学方程,具有一定的缓释效果。

表3 烯丙孕素缓释微球体外释放曲线方程拟合

表4 烯丙孕素缓释微球药物稳定性的影响因素

2.5 烯丙孕素缓释微球药物稳定性的影响因素

由药物稳定性影响因素试验结果可知,高湿的条件对烯丙孕素缓释微球的药物稳定性影响较小,烯丙孕素含量无明显降低,且无吸湿结晶的现象出现,而保存在高温以及强光照射的条件下对烯丙孕素缓释微球中烯丙孕素的含量有着明显影响,在60℃的环境中储存10 d后,烯丙孕素的含量减少3.00%,在照度4500 lx±500 lx的条件下储存10 d后烯丙孕素的含量减少更为显著,达到11.92%。因此,烯丙孕素缓释微球需要在低温阴暗的环境下储存。

3 讨论

在烯丙孕素缓释微球的制备时,mPEG-PLA的理化性质如分子量、聚合物的比例等对微粒的粒径、包封率及降解速率直接相关,如低分子量的聚合物表现出较高的药物释放速率以及降解速率[12],因此在考虑mPEG-PLA性能及经济效益的同时,本试验选取mPEG2000-PLLA10000进行研究。在mPEG-PLA溶剂的选择上,本试验考察了mPEG-PLA分别在乙醇、甲醇以及二氯甲烷中的溶解效果,结果表明,mPEG-PLA在二氯甲烷中的溶解效果最佳,且二氯甲烷具有强挥发性,可加快烯丙孕素缓释微球的制备速度。

本试验经过工艺优选制备得到的烯丙孕素缓释微球包封率和载药量高,优于其他同为mPEG-PLA为载体制备的载药微球[13],高包封率归功于烯丙孕素的脂溶特性,因此烯丙孕素易于保留在微球的有机相内。最佳制备条件下,微球的平均粒径较小,但是粒径跨距较大,这可能是残留的明胶颗粒造成的,后续试验将进一步优化烯丙孕素缓释微球的分离工艺以达到均匀粒径的目的。

长效载药微球在体内的释药时间较长,因此需要进行体外加速释放试验对其释药特点进行研究,从而快速评价载药微球的释药方式,加快研发、生产进程[13]。另外,根据《中华人民共和国兽药典》规定,对于难溶性药物,可在溶出介质中添加适量的表面活性剂。经过筛选,在溶出介质中添加1%的吐温-80既可以使烯丙孕素满足在溶出介质中的漏槽条件,而且能加快烯丙孕素缓释微球的药物释放。在体外释放试验中,烯丙孕素缓释微球的释放曲线符合一级释放模型,具有缓释效果,但烯丙孕素缓释微球在初始阶段释药速度较快,主要原因有以下两点:(1)药物在微球中主要以吸附、镶嵌和包埋的方式存在,微球表面吸附的药物快速释放是初始阶段出现“突释效应”的主要原因,PU等[14]通过共聚焦显微镜观察黄体酮微球中黄体酮的分布情况,发现黄体酮在微球表面分布十分密集,本试验中烯丙孕素缓释微球和空白微球的电镜结果也证明,烯丙孕素缓释微球的表面吸附着大量的烯丙孕素原药;(2)微球粒径是影响药物释放的重要因素,球径越小,释放速度越快[15-16]。后续的研究应进一步改进烯丙孕素缓释微球的制备工艺,优化烯丙孕素缓释微球中药物的存在形式,以降低突释的影响。

烯丙孕素一个重要的理化性质是在光照条件下易发生化学结构的转化,导致其活性丧失[17]。本研究使用mPEG-PLA对烯丙孕素进行包埋,能减缓微球内部的药物光解的速度,增强药物在光照条件下的稳定性,但微球表面吸附有部分药物,因此在光照稳定性试验中主要是微球表面的烯丙孕素分解而导致药物含量的下降。烯丙孕素缓释微球在高温条件下稳定性一般,在高湿条件下稳定性良好,因此烯丙孕素缓释微球需要在低温、避光的条件下储存。

Li Y等[18]进行了国产与进口两种烯丙孕素口服溶液的药代动力学比较研究,结果显示,两种烯丙孕素口服溶液的消除半衰期分别为3.63 h±0.72 h和3.45 h±0.63 h,可见,现代养猪业常用的烯丙孕素制剂体内半衰期短,消除速度快,而烯丙孕素缓释微球研究不仅有助于解决烯丙孕素的这些缺点,提高生物利用度,更为烯丙孕素长效制剂的研发提供了理论依据。

综上所述,在最佳制备条件下烯丙孕素缓释微球的包封率高,载药量好,外观圆整,粒径较小。烯丙孕素缓释微球具有缓释效果,需要在避光、低温条件下保存。