慢性乙型病毒性肝炎湿热类证潜在miRNA表达谱研究*

苏 悦，罗雪梅，彭杨芷，党思捷，刘西洋，姜 岑△

(1.成都中医药大学 610075；2.四川省雅安市中医院 625000)

慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是HBV持续感染引起的慢性肝脏炎性疾病，病毒性HBV表面抗原(HbsAg)和(或)HBV-DNA持续阳性6个月以上。病毒性肝炎是一项世界性的公共卫生问题，据WHO 2017年报道，全球约有2.57亿HBV感染者(HBV表面抗原阳性)，仅2015年，全球HBV及其并发的肝硬化和肝细胞癌等约致88.7万人死亡。在我国，CHB的发病率也长期居于法定传染病的前列，国家卫生健康委员会疾病预防控制局(CDC)2017年6月的数据显示，新增HBV约占新增甲乙类传染病总数的30.8%，CHB的发病人数及病死率仍处于较高的水平，给社会经济及人民的健康带来较为沉重的负担，深入开展CHB的防治工作仍十分必要。

中医药是中华文明的重要载体，数千年来为华夏民族的健康保驾护航，中医重视“治未病”，在CHB的防治中具有自身的特色和优势，在准确辨证的前提下遣方用药，能起到改善患者生存质量，降低肝纤维化的发生，促进肝功能恢复的作用。中医辨证讲究四诊合参，但由于CHB证候复杂多变，给辨证带来了较大难度，寻找客观的生物学标志物有利于提高辨证的准确性，充分发挥中医药防治CHB的优势。大量研究发现,湿热类证(脾胃湿热证、肝胆湿热证、中焦湿热证、湿热内蕴证、脾虚湿热证等)是CHB的常见证型[1-3]，因此本研究选择湿热类证中的脾胃湿热证、肝胆湿热证、脾虚湿热证作为研究对象，筛选其共有的miRNA，探索湿热类证潜在的表达谱。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究50例患者来源于成都市公共卫生中心及上海中医药大学附属曙光医院。设脾胃湿热证组、肝胆湿热证组、脾虚湿热证组、无证可辨组、健康对照组，每组各10例。各组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2纳入标准

1.2.1CHB的纳入标准 血清HBsAg阳性至少在6个月以上；病毒载量阳性；1年之内血清学检查丙氨酸氨基转移酶(ALT)持续或反复升高；年龄在18～60岁的患者；签署知情同意书，自愿加入实验研究，依从性较为满意者；在试验进行过程中无计划迁离当前的试验地点。符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2010年版)[4]的规定，推荐接受抗病毒治疗的患者。

1.2.2中医证型的纳入标准

1.2.2.1脾胃湿热证组 主证：(1)脘腹胀闷；(2)苔黄腻。次证：(1)恶心，厌油，纳呆；(2)身目发黄，色泽鲜明或尿黄；(3)大便黏滞臭秽。辨证要求：具备以上所有主证的临床证素，即属本证；具备主证(1)及次证(1)、(2)者；具备主证(2)及次证3项中的任何2项者。

1.2.2.2肝胆湿热证组 主证：(1)胁肋胀痛；(2)舌苔黄腻。次证：(1)纳呆呕恶，厌油腻；(2)身目发黄；(3)尿黄。辨证要求：具备以上所有主证的临床证素，即属本证；具备主证(1)及次证3项中的任何2项者，即属本证；具备主证(2)及次证(1)、(2)者，即属本证。

1.2.2.3脾虚湿热证组 主证:乏力；纳食减少；舌苔黄。次证:腹胀脘闷；少气懒言；口苦黏；恶心厌油；四肢倦怠；尿黄；大便干结或溏垢或先干后溏；脉弦数或沉弦。辨证要求：主症符合 3项，次症符合1项以上。

1.2.2.4无证可辨组 符合CHB的诊断，但症状、体征隐匿，中医四诊难以明辨证型。

1.2.2.5健康对照组 年龄18～60岁，身体质量指数19～24 kg/m2；不嗜烟酒；体格检查无异常，无心、肺、肝、肾、消化道、代谢异常等病史；女性志愿者排除怀孕、月经期。

1.3排除标准 合并其他类型肝炎病毒和/或HIV感染者；合并肝硬化、恶性肿瘤者；确诊为重型肝炎者(含急性、亚急性及慢性重症肝炎)；合并药物性或中毒性肝损害、自身免疫性肝炎、遗传-代谢性肝脏疾病；合并有心、肺、肾、内分泌、血液等严重疾病者；怀孕妇女，哺乳期妇女；有精神疾患，符合中国精神障碍分类与诊断(CCMD-3)标准；过敏体质或已知对中药某些成分过敏的患者；有其他中医类兼夹证者。符合以上任何1条，均不能纳入本临床研究。

1.4方法 病例纳入后，采集清晨空腹肘静脉全血，进行标本预处理后得到血浆1 mL，由成都博奥独立医学实验室有限公司的专业技术人员进行检测。本研究采用基因芯片技术，运用Agilent19.0芯片进行检测，通过对比5组miRNA的表达情况，筛选出差异显著的miRNA作为CHB 3种湿热类证的差异miRNA，将这些miRNA在MiRNA Targets Prediction(v2.0 beta)数据库中(Targetscan、miRDB、TarBase、miRTarBase)预测靶基因，然后将筛选出来的靶基因导入富集分析系统里(数据包为clusterProfiler来自R/bioconductor),采用Fisher精确检验，挑选落在相同GO与pathway上的基因数目大于或等于4，P<0.05，富集程度从大到小的前30个结果，以探索差异miRNA的功能。

2 结 果

2.1CHB湿热类证潜在miRNA表达谱 脾胃湿热证组与健康对照组、隐证组比较，共筛选出具有显著差异的miRNA 9条(P<0.05；差异倍数大于2.0)，其中6条表达上调，3条表达下调；肝胆湿热证组与健康对照组、隐证组比较，共筛选出具有显著差异的miRNA 14条，均表达上调；脾虚湿热证与健康对照组、隐证组比较，共筛选出具有显著差异的miRNA 17条(P<0.05；差异倍数大于2.0)，均为表达上调。hsa-miR-1260a为脾胃湿热证、肝胆湿热证、脾虚湿热证3组共有的miRNA(P<0.05；差异倍数大于2.0)，在各组中均表达上调，见表1。

表1 3组湿热证hsa-miR-1260a的表达情况

2.2CHB湿热类证潜在miRNA表达谱的靶基因预测及富集分析结果 本研究共获得hsa-miR-1260a靶基因3 302条，GO富集分析显示，其主要与肝素钠反应、顺铂反应、肾素分泌、上调Wnt信号通路，上调纤维细胞生长因子受体信号通路，正向调节多巴胺的分泌，上调碱性磷酸酶的活性、核包涵体、非膜生成蛋白质酪氨酸磷酸酶活性，负向调节IL-17的生成、血管内皮生长因子激活受体活性、小脑浦肯野细胞分化，活化蛋白激酶活性等具有相关性。

KEGG富集分析结果显示，hsa-miR-1260a靶基因主要与Wnt信号通路、维生素B6代谢、泛素介导的蛋白水解、甲状腺癌、内质网的蛋白进程、磷脂酰环己六醇信号系统、其他类O-聚糖的合成、烟酸盐与烟酸胺的代谢、黏蛋白O-聚糖的合成、黑素生成、赖氨酸退化、亚油酸代谢、肌醇磷酸代谢、肥厚性心肌病、Hedgehog信号通路、粘多糖合成、乙醚代谢、基底细胞瘤、α亚麻酸代谢、脂肪细胞因子通路等具有相关性。

3 讨 论

中医学并无CHB病名，然据其临床表现，可归属于“黄疸”“胁痛”等病的范畴，中医将CHB的病因概括为湿热、气滞、血瘀、正虚等方面，其中“湿热”最为常见也最为重要。早在《素问》中就提出“湿热相搏，民病黄疸”，湿性重着，郁久化热，湿热胶阻，胆汁不循常道，出于白睛、肌肤、小溲，则发为黄疸；湿热阻滞气机，故而胁痛、脘腹胀；湿热阻滞，脾失健运，而见纳差、恶心、厌油；湿热下注，则出现大便黏腻、小便黄赤；湿热搏结脉道、上犯于舌，可见脉滑数、舌红苔黄腻。CHB以湿热留恋部位的差异，又有脾胃湿热证、肝胆湿热证、湿热内蕴证等，或有素体脾虚，兼受湿热疫毒外袭所发之脾虚湿热证，其病因却均不离“湿热”二字。因此，笔者以“湿热类证”概括上述证型，试图运用现代生物学技术探寻其潜在的生物学本质。

随着系统生物学、生物信息学的发展，近年来运用现代生物学技术探索中医证候生物学本质的研究很多，均从不同的角度寻找了证候的生物学标志物，有利于中医证候理论的深化。如刘畅[5]用代谢组学方法研究湿热证“异病同证”的物质基础，发现CHB差异物质27种、非酒精性脂肪性肝病28种、慢性肾小球肾炎24种，3种疾病的湿热证共同变化的物质为肌苷、鸟苷、天门冬氨酸、油酸甘油酯、乳酸盐。魏嵋等[6]运用血浆蛋白质组学对CHB湿热中阻证的研究发现，差异表达蛋白质血清载脂蛋白A1(APO-A1)、载脂蛋白A4(APO-A4)可潜在作为CHB湿热中阻证诊断、预后标记物及治疗靶点。党思捷等[7]从转录组学角度，探索了CHB脾胃湿热证与肝胆湿热证生物学基础的差异。本研究针对湿热类证中较为常见的脾胃湿热证、肝胆湿热证，虚实夹杂性质的脾虚湿热证进行研究，从miRNA的角度探索湿热类证的潜在生物学表达谱，是对中医证候生物学标志物的又一尝试。

miRNA是一类20～24 nt的非编码RNA，通过影响mRNA的结构和转录功能，参与多细胞器官基因表达的转录后调控。miRNA在人体生理、病理过程中发挥重要作用[8]，可作为潜在的诊断标志物[9]。hsa-miR-1260a在既往的研究报道中，有学者发现其在强制性脊柱炎[10]患者中表达下调，在狼疮肾[11]中表达上调，但这些研究均未涉及中医证型。本研究发现，hsa-miR-1260a同时存在于CHB典型的3种湿热证型中，且于各组中FC值存在着差异，说明其在湿热类证中具有相对的特异性，有助于辅助CHB湿热类证的诊断及鉴别诊断，对其进行进一步研究也有利于揭示CHB湿热类证的本质。本研究对hsa-miR-1260a进行靶基因预测，得到3 302条靶基因，功能分析发现其参与调控Wnt信号通路、维生素B6的代谢、肝素钠反应等，其调控湿热类证形成的机制仍待进一步的研究。