基于网络药理学探讨葛根治疗高脂蛋白血症的潜在作用靶点

治丁铭，隋殿军，岂 蕊，苗永迪，韩 冬，娄石磊，邱 悦，孙 聪

(1.长春中医药大学针灸推拿学院针灸基础教研室，吉林 长春 130117；2.长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室，吉林 长春 130117；3.长春中医药大学基础医学院生物化学教研室，吉林 长春 130117)

葛根(pueraria)是豆科植物野葛或粉葛的干燥根，始载于《神农本草经》，产地主要分布在吉林、辽宁、河北和河南等地，属于吉林省道地药材。葛根性凉，味甘、辛，具有解表退热、生津、透疹、升阳止泻等功效[1]。葛根中主要活性物质是异黄酮，如葛根素、3-羟基葛根素、3-甲氧基葛根素和葛根素-木糖苷等，其次是大豆苷、大豆苷元和花生素等，其中葛根素占主体[2]，还含有蛋白质、氨基酸、糖和铁、钙、铜、硒等矿物质[3]，是名贵滋补品，有“千年人参”之美誉。葛根素具有扩张冠状动脉、抗心律失常、抗心肌缺血、抗脂质过氧化、抗血小板聚集和降血压等心血管药理作用，主要用于心脑血管疾病的治疗[4]；还具有降血糖、降血脂、抗氧自由基和解痉等功能，但其具体作用机制尚不完全清楚。

随着基因、蛋白和代谢组学的发展，许多学者尝试用现代医学解释中药的作用机制。但由于中药多成分、多途径和多靶点的特点，很难明确药效物质基础。基于数据库的共享和系统生物学的理论，Hopkins[5]提出了网络药理学(network pharmacology)概念和研究方法，通过搜集数据库的信息，构建系统网络预测多分子协同作用机制。陶灵佳等[6]从TCM-PTD获取健脾补肾复方中药的分子、靶标，建立中药分子-靶标互作网络，筛选出378个中药分子和63个大肠癌靶标，其相互作用共125组。李刚等[7]通过网络拓扑分析淫羊藿，筛选出221个关键基因及淫羊藿治疗骨质疏松症Wnt、TGF-β和Notch等信号通路。本文作者采用网络药理学构建“药物-靶点-疾病”的复杂网络关系，预测葛根抗高脂蛋白血症(hyperlipoproteinemia)的活性成分和潜在作用靶点，探讨其抗高脂蛋白血症的作用机制，为后续实验研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 葛根潜在作用靶标的预测

1.1.1 葛根小分子化合物信息 采用台湾中医药资料库[8](TCM Database@Taiwan)、PubMed、SinoMed和化学数据库等收集葛根的化学成分，得到22个已知化学成分信息。

1.1.2 葛根相似药物和潜在作用靶标 采用Drugbank数据库预测葛根中化学成分的相似药物。Drugbank数据库中包括详细的药物数据(如化学数据、药理数据、药物数据)和综合的药物靶点信息(如序列、结构和作用途径)[9]。基于结构相似性原理，利用Drugbank中的similarity工具，获得与葛根所含化学成分具有相似化学结构的已知药物分子(结构相似度标准：similar score≥0.7)，并将已知相似药物做为葛根药物的候选靶标分子通过Mechanism afaction寻找其作用靶标。

1.2 高脂蛋白血症相关基因

基于TTD(Therapeutic Target Database)、DrugBank、GAD(Genetic Association Database)和OMIM数据库[10-11]，以“hyperlipoproteinemia”为关键词进行检索，获取、筛选整理与高脂蛋白血症相关的蛋白。

1.3 网络构建与分析

基于蛋白质与蛋白质、化合物与蛋白质之间互作关系信息，采用HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、STITCH、DIP、PDZBase、BIND和STRING数据库，检索选择置信度高的分子(置信度标准：confidence≥0.7，high confidence)进行整合建立互作网络。采用Cystoscape 3.6.0软件[12]进行网络构建、分析和可视化工作，“节点”代表分子如化合物、蛋白质和疾病，“边”代表分子间相互作用关系如葛根活性成分与靶点、靶点与疾病、葛根活性成分、靶点与疾病的交互。通过评价网络的拓扑结构特性来分析，构建葛根活性成分-靶标-疾病的相互作用网络，通过分析葛根活性成分与靶点、靶点与疾病之间的复杂关系，预测药物治疗高脂蛋白血症潜在的靶点及作用机制。

2 结 果

2.1 葛根潜在作用靶标

获得51个与葛根中9种化学成分具有相似化学结构的已知药物分子，见表1。删除重复者后得到葛根中7种化学成分可能的60个蛋白靶标(其中2种成分Formononetin和Genistein-8-c-glucoside的相似药物未找到靶标蛋白)。见表2。

表1 与葛根化学成分相似化学结构的药物分子

表2 葛根化学成分作用靶点

2.2 靶点-疾病网络药理学

将各数据库检索结果进行筛选整理，获得与高脂蛋白血症疾病相关的28个蛋白，包括载脂蛋白E(APOE)、三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1(ABCA1)、载脂蛋白AⅠ(APOAⅠ)、载脂蛋白AⅡ(APOAⅡ)、载脂蛋白AⅤ(APOAⅤ)、载脂蛋白B(APOB)、载脂蛋白CⅠ(APOCⅠ)、载脂蛋白CⅡ(APOCⅡ)、雄激素受体(AR)、肉毒碱棕榈酰基转移酶2(CPT2)、细胞色素P450(CYP450)、胞浆环氧化物水解酶抗体(EPHX2)、科凯恩综合征相关蛋白/早衰蛋白CSA抗体(ERCC8)、凝血因子Ⅺ(FACTOR Ⅺ)、纤维蛋白原A(FGA)、生长激素受体(GHR)、糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白结合蛋白1(GPIHBP1)、G底物(GSBS)、中间α-球蛋白抑制因子H4(ITIH4)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、谷胱甘肽磷酸胆固醇-高密度脂蛋白结合蛋白1(LIPI)、脂肪酶成熟因子1(LMF1)、核纤层蛋白(LMNA)、溶血磷脂酸(LPA)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARA)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)和RP1基因(RP1)。

通过软件String 10.0和Cytoscape 3.6.0，用预测得到的药物成分对应的60个靶点蛋白和28个疾病相关蛋白构建“靶点-疾病”相互作用网络图，见图1。分析网络拓扑结构显示：此网络包括54个节点和157条边，其中54个节点包括22个疾病蛋白和32个靶点(其中包括3个共有成分)，每条边表示疾病蛋白和靶点之间的相互关系，平均节点的degree值为4.76，聚集系数为0.451。Degree值超过平均值的靶标蛋白：Src、NF-κB、PPARs、雌激素受体α(Esr1)、AHR、APOAⅠ、APOAⅡ、APOAⅤ、APOB、APOCⅠ、APOCⅡ、APOE、LDLR、LPL、ABCA1、LPA、GPIHBP1和FGA，Cyp158A2和AR既是疾病相关蛋白又是药物活性成分的靶点。预测这些蛋白可能是葛根治疗高脂蛋白血症的潜在靶点。

2.3 葛根活性成分-靶点-疾病网络药理学

将葛根活性成分-靶点的对应关系输入到Cytoscape3.6.0软件，得到的网络与疾病蛋白-靶点网络图合并，直观得到葛根中活性成分治疗高脂蛋白血症的潜在靶点，见图2(插页一)。图中长方形代表葛根中的7个化学成分，三角形代表疾病的蛋白，椭圆形代表葛根化学成分的靶点。

2.4 KEGG通路富集分析

通过String10.0软件，对靶点-疾病网络中涉及的蛋白在信号通路中的作用进行KEGG pathway富集分析，得到12条信号通路，根据P<0.01筛选出8条，其中KEGG pathway通过查看基因在通路中的分布情况，可以了解该基因在代谢、信号转导等通路中的作用。见表3。

表3 与高脂蛋白血症相关的葛根潜在靶点富集的通路

3 讨 论

本研究采用网络药理学筛选出葛根治疗高脂蛋白血症的7种活性成分。通过活性成分-靶点-疾病网络特征分析，得到20个潜在治疗靶点。PPAR可通过调节脂质代谢、抑制炎症发挥作用。Esr1具有抗炎、促血管损伤修复、增加冠状血流量的作用。NF-κB参与急慢性炎症反应。CYP450是可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶；哺乳动物的CYP450是膜的组分，参与生物合成和许多生理活性物质的代谢。AR是核受体超家族中的类固醇受体，影响脂肪细胞分化、促进脂解作用和抑制脂质合成，减少脂肪在脂肪组织中的沉积，改善肝脏代谢，对心血管系统具有保护作用。APOAⅠ在胆固醇逆向转运、抑制LDL的氧化修饰、保护血管内皮细胞及稳定细胞膜结构方面发挥重要作用。APOAⅡ与APOAⅠ一样，具有抗动脉粥样硬化的作用。APOAⅤ是甘油三酯代谢的关键酶LPL的激活剂，促进甘油三酯分解。APOB介导LDL与相应受体结合，调节LDL从血浆中清除。APOCⅠ抑制LPL活性，通过改变APOE结构使富含甘油三酯的脂蛋白延时清除。APOCⅡ激活LPL活性，也会通过改变LPL的空间结构激活LPL，催化水解甘油三酯。LPL是调节脂质代谢的关键酶，通过水解血浆中富含甘油三酯的脂蛋白为机体组织提供游离脂肪酸氧化供能。LPA是细胞膜脂类衍生物，有可能作为分子标记物，反映血小板等细胞的活化状态，预警血栓形成的危险性。GPIHBP1在富含甘油三酯脂解过程中发挥重要作用，协助LPL转运。ABCA1是细胞膜上重要的胆固醇流出调节蛋白，将细胞内的胆固醇转运到细胞外，再经HDL运送到肝脏转化为胆汁酸完成胆固醇代谢。FGA既是炎症标志物又是凝血因子，FGA水平增高是动脉硬化的独立危险因素。

图1 高脂蛋白血症相关蛋白-葛根化学成分潜在靶点网络

Fig.1 Network of hyperlipoproteinemia-related proteins-potential targets of chemical constiuents of pueraria

综合分析显示：葛根中的黄豆苷、葛根素通过EP300与PPARs发生相互作用，PPARs在人和啮齿类动物中包含PPARα、β和γ 3种亚型，PPARα主要在肝脏表达，可调控多种靶基因的表达，参与脂代谢所有过程如脂肪酸摄取、结合与氧化，脂蛋白组合、运输与代谢的基因，是脂代谢关键的调节因子，促进过氧化物酶体和线粒体的脂肪酸β-氧化，加速脂肪酸的分解，促进胆汁酸的生成，对清除血中的胆固醇起着重要作用。体内合成的胆固醇和从血浆脂蛋白中吸收的胆固醇均需转化成胆汁酸或以游离胆固醇形式经肝胆管排出，CYP7A1是胆固醇转化为胆汁酸的限速酶[13-14]，在胆固醇的代谢中起重要作用，CYP7A1表达依赖PPARα。而CYP7A1是CYP450家族中的成员，除了在骨骼肌和成熟的红细胞外所有的组织和器官均表达。研究[15-16]显示：PPARα激活剂GW7845和PPARγ配体WY14643、罗格列酮可提高巨噬细胞ABCA1 mRNA水平，促进细胞内胆固醇流出。PPARγ影响GPIHBP1的表达，在GPIHBP1的调控序列上发现许多PPARs的结合位点，其中5个是结合PPARγ的。GPIHBP1通过与乳糜微粒上带有正电荷的载脂蛋白A5、E、B48结合，同时与LPL结合发挥脂解平台的作用。

葛根中花生四烯酸(arachidonic acid)是生物体内含量丰富、分布广泛的多不饱和脂肪酸，可经CYP450氧化酶途径代谢为环氧化二十碳三烯酸(EETs)，降解为活性较弱的二羟基-20碳三烯酸[17]。CYP450-EETs系统在调节机体脂代谢方面发挥重要作用，过表达可减轻高脂饮食诱导的肥胖小鼠皮下及内脏脂肪的积聚，减轻肥胖小鼠体质量，改善高脂诱导的血管功能异常[18]；可通过抑制脂毒性相关的炎性反应和氧化应激从而减轻高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏脂肪变性[19]。研究[15]显示：CYP和EETs均是PPARα的配体激动剂。葛根中的甾醇类药物是γ-谷甾醇，预测发现其相似药物的靶标分子是通过AR和Esr1发挥作用的，睾酮有改善脂质代谢的作用，雌激素能提高肝脏中ABCA1的表达水平。Nettleship等[20]观察睾酮及AR功能缺失的睾丸雌性化的小鼠发现：睾酮水平与HDL呈正相关关系；Haffner等[21]的流行病学调查发现：睾酮与脂质代谢有关，睾酮水平与总胆固醇、LDL及甘油三酯呈负相关关系；Malkin等[22]对性功能减退男性采用睾酮替代治疗可改善血脂代谢，降低总胆固醇，降低炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1和6(IL-1和IL-6)的表达，提高IL-10表达；睾酮的调脂机制可能是通过激活肝脏的LPL，使游离脂肪酸向外周组织转运，促进其进入三羧酸循环氧化分解。Esr1与雌激素结合，调节血管平滑肌细胞和内皮细胞的功能，影响血管的收缩和舒张；还可通过改善脂代谢，降低总胆固醇和LDL，增加HDL水平，Esr1具有抗炎、促血管损伤修复、增加冠脉血流量等多重作用[23]。

综上所述，本文作者推测葛根的有效成分通过上述靶点相互作用，实现其降脂、抗炎和改善血管弹性等作用。本研究结果为后续的实验研究提供了科学依据。