壳聚糖膜覆盖3D打印双相磷酸钙骨组织工程支架的制备和性能

夏轶超，澈力格尔， 李宝印， 文 静， 孙静淳， 王宁宁， 韩 冰

(1.吉林大学口腔医院口腔颌面外科，吉林 长春 130021；2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室,吉林 长春 130021)

临床上由肿瘤、外伤、先天畸形和感染等造成的骨缺损不仅会影响外部的美观和功能，而且会给患者带来生活上的不便，甚至威胁生命。目前临床上对于骨缺损治疗的黄金标准是自体骨移植，但是自身可提供移植骨的部位有限，并且给原来健康的部位造成了损伤，给患者造成二次伤害[1]。异体骨移植由于免疫反应，使其应用受到了限制[2]。组织工程旨在结合细胞、生物材料及适当的生物化学因子，来引导新组织的形成。在理想的状态下，支架作为载体，是组织工程中最基础也是不可或缺的一部分[3]。前期研究[4]显示：羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)与β-磷酸三钙(Beta - tricalcium phosphate，β-TCP)组成的生物活性材料双相磷酸钙(biphasic calcium phosphate，BCP)，其化学组成与骨组织的无机成分相似，并解决了HA难以降解以及β-TCP降解过快的问题，且其具有HA和β-TCP具备的骨诱导性、骨传导性和生物相容性，在骨组织工程支架研究中广泛应用。Macchetta等[5]采用冷冻干燥技术制作出多孔BCP/CS支架，其抗压强度可与松质骨相媲美。Petit等[6]通过X射线断层技术发现：单纯BCP支架随着降解会使其脆性完全表现出来，导致断裂。壳聚糖(chitosan，CS)是自然界唯一带正电荷的天然碱性多糖，其具备可降解性、抗菌性、可塑性高并且支持细胞黏附、增殖和分化等特点，但其机械性能差，故不能单独作为组织工程支架[7]。CS在医学领域应用广泛，其作为创口愈合的敷料具有良好的效果，作为药物缓释控释载体表现出了良好的功能，对于牙周组织再生有一定疗效，最近CS在骨组织工程领域也受到了广泛的关注，具备骨组织工程支架材料的潜力[8]。本文作者拟采用3D打印技术，制备出精确孔隙大小的多孔隙相互连通的立体结构BCP支架，再使用化学方法制备CS溶液，覆盖于BCP支架上，构建出BCP/CS复合骨组织工程支架，观察材料的表征、理化性质、毒性测试及与小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)共培养的增殖情况，探索CS膜覆盖于材料上对于原本材料的影响，探讨其成为骨组织工程支架材料的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器HA、β-TCP和聚乙烯(PVA)(中科院上海市硅酸盐研究所)，CS和CCK-8试剂盒(美国Sigma公司)，乙酸和H-DMEM培养基(美国Hyclone公司)，FBS(美国Gibco公司)。三维打印机(德国弗劳恩霍夫研究所)，CO2恒温培养箱(日本Sanyo公司)，酶标仪(美国Bio-RAD公司)，扫描电子显微镜(SEM，SSX-550，日本SHIMADZU公司)，原子力显微镜(AFM，德国Bruker公司)，恒温烘干箱(上海精宏实验设备有限公司)

1.2 支架的制备选择纳米级HA和β-TCP粉末，质量比为3∶7的比例混合，以可溶于水且易于脱粘的PVA为粘结剂。将上述粉末与PVA水溶液(质量比6%)均匀混合配成可注射的膏状物。注射针头压力控制在200～400 kPa，移动速度为6 mm·s-1。根据预设的模型数据控制针头在三维方向定向移动分层打印，直至整个支架打印完成。模型在室温下干燥24 h，1 100℃烧结3 h，去除支架材料中的PVA，BCP支架最终成型[9]。制备的支架为长方体，高3 mm，边长10 mm，孔隙率为400 μm。将制备完成的BCP支架用乙醇浸泡超声消毒去除杂质，烘干备用。配置1%乙酸溶液和5%氢氧化钠溶液备用。称取CS粉末放入烧杯中，使其溶于1%乙酸，磁力搅拌至CS粉末完全溶解，真空干燥箱抽空气泡后，放入BCP支架，超声震荡10 min使支架孔隙中的气泡基本析出，放入真空干燥箱2 h使CS溶液中的气泡完全消失，CS溶液附于支架上。取出后，迅速用干净的镊子夹取CS溶液覆盖的BCP支架于48孔板中，放入真空干燥箱，55℃真空干燥24 h。完全干燥后取出放入烧杯，用5%氢氧化钠溶液浸泡30 min，完全去除乙酸，蒸馏水冲洗材料至中性，完全烘干，最终制备成BCP/CS复合支架。

1.3 BCP/CS支架与BCP支架表面形态观察采用原子力显微镜观察干燥后支架表面的粗糙度。然后支架表面喷金，采用扫描电子显微镜观察支架表面的微观形态。

1.4 支架吸水率的测定支架完全烘干后质量为W1，将干燥后的支架浸于室温双蒸水中24 h，取出后用滤纸吸去材料表面的水分，称质量为W2。吸水率(X)=(W2-W1)/W1×100% 。每组5个样本，取平均值。

1.5 小鼠MC3T3-E1细胞的培养选用小鼠颅骨来源的MC3T3-E1细胞系，在37℃、5%CO2的细胞孵育箱中培养。培养基为含10%胎牛血清和1%双抗的H-DMEM。观察细胞状态，2 d换液1次，细胞铺满培养瓶80%以上时，胰酶消化传代。

1.6 支架浸提液的制备BCP/CS支架与BCP支架去离子水超声震荡，烘干，高压灭菌备用。遵循国家标准(GB/T16886.11-1997)中医疗器械浸提方法，按照表面积/浸提介质=3 cm2·mL-1加入H-DMEM培养基(10%FBS、1%双抗)，在CO2恒温细胞培养箱中静置 72 h，得到BCP/CS和BCP支架的浸提液，4℃保存备用。

1.7 细胞毒性实验将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，制备成细胞悬液后调整细胞浓度为2×104mL-1，吸取100 μL加入96孔板中。放入细胞孵育箱4 h使细胞贴壁，然后取出更换培养液。实验分为3组：BCP/CS组(BCP/CS支架浸提液)、BCP组(BCP支架浸提液)和空白组(单纯培养基)，每组设6复孔。各组细胞在培养1、3和5 d后，于超净台中每孔加入10 μL CCK-8溶液，放回细胞孵育箱，避光孵育2 h后取出，用酶标仪在波长450 mm处检测吸光度(A)值。细胞相对增殖率(RGR)=(实验组A值/空白组A值)×100%。按照国家标准(GB/T16886.5-2003)对2个实验组的RGR进行评级：0级，RGR>100%；1级，80%

1.8 细胞增殖实验BCP/CS支架和BCP支架(分别为BCP/CS组和BCP组)经去离子水超声振荡清洗，烘干，高压蒸汽灭菌后放入48孔培养板中，每孔放置1件材料，空白组为单纯培养基，每组设3复孔。取对数生长期的MC3T3-E1细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，每孔接种细胞数量为2×104个。分别培养1、3、5和7 d后终止培养，在超净台中每孔分别加入50 μL CCK-8溶液，细胞孵育箱避光孵育2 h后，每孔吸取100 μL液体至新的96孔板中，保证无气泡后用酶标仪在波长为450 nm处检测A值。各组细胞增殖活性以A值表示。

2 结 果

2.1 支架的结构BCP支架和BCP/CS复合支架均为长方体，支架孔隙大小均匀，孔隙间相互连通。与BCP支架比较，BCP/CS支架表面无明显变化，灯光下可见表面覆盖一层浅黄色膜。见图1A和B(插页三)。

2.2 原子力显微镜和扫描电子显微镜观察支架表面粗糙度和超微结构原子力显微镜观察支架表面粗糙度：BCP支架和BCP/CS支架表面均凹凸不平，BCP支架的表面粗糙度为860 nm，BCP/CS支架的表面粗糙度为710 nm(轮廓算数平均差)。见图1C和D(插页三)。

扫描电子显微镜观察支架表面超微结构：BCP/CS支架孔隙相互连通，孔隙为250～300 μm，支架表面粗糙不平，有许多微孔，CS膜不仅覆盖在支架的表面，并且渗入了微孔中，覆盖于孔壁上，并且未改变其表面微孔形态(图2)；BCP支架表面光滑，孔隙相对于BCP/CS支架较大，为350～450 μm(图3)。

A：Bar=1 mm;B：Bar=500 μm;C：Bar=20 μm;D：Bar=5 μm.

A：Bar=1 mm; B：Bar=500 μm; C：Bar=20 μm; D：Bar=5 μm.

2.3 支架吸水率BCP支架吸水率为(32.00±2.43)%，BCP/CS支架吸水率为(37.75±2.21)%， 2组支架吸水率比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 细胞毒性实验在体外培养1、3和5 d时，BCP/CS支架和BCP支架毒性等级均分别为0级、1级和1级，表明BCP/CS和BCP支架均无细胞毒性。各组支架RGR值及对应的细胞毒性等级见表1。

2.5 各组细胞增殖活性 将支架与细胞共培养1、3、5和7 d后，各组细胞增殖活性随时间的延长而增加。在共培养1 d后,BCP组和BCP/CS组的细胞增殖活性均低于空白组(P<0.05)；培养3 d时，BCP组和BCP/CS组的细胞增殖活性明显低于空白组(P<0.05)；培养5 d后，与空白组比较，BCP/CS组细胞增殖活性无明显变化(P>0.05)，但与BCP组比较差异有统计学意义(P<0.05)；培养7 d后，BCP/CS组细胞增殖活性明显高于空白组和BCP组(P<0.05)，BCP组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 2组支架细胞毒性实验的RGR和毒性等级

Tab.1 RGR in toxicity test and toxicity grades of scaffolds in two groups

GroupRGR(η/%)(t/d)135Toxicity grade1 3 5BCP1079490011BCP/CS1089687011

表2 各组细胞增殖活性

GroupA value(t/d) 1357Blank0.236 6±0.010 50.339 0±0.031 70.413 5±0.028 40.430 6±0.176 7BCP0.229 6±0.020 6∗0.263 7±0.164 8∗0.368 5±0.028 6∗0.413 1±0.166 6BCP/CS0.205 6±0.005 8∗0.248 7±0.013 7∗0.402 3±0.007 5△0.458 6±0.186 7∗△

*P<0.05 compared with blank group；△P<0.05 compared with BCP group.

3 讨 论

本课题组的前期研究探索出了3D打印制备HA与β-TCP支架的方法以及质量比为3∶7的比例，同时支架的表面形态和物理化学性能均符合骨组织工程支架的要求，通过原子力显微镜和扫描电子显微镜可见支架具有良好的形态[10]。组织工程的出现使组织缺陷的治疗方法进入了一个新的时代，医学从治疗医学、预防医学过渡到了再生医学。在组织工程领域中，由于细胞与生长因子都必须负载于支架上，而其复合体又要植入人体中，所以合适的支架必须符合人体的物理化学性能，并具有良好的生物相容性[11]。

3D打印技术是以计算机三维设计为基础，通过将材料逐层沉积并精准地控制其内部形态，形成预设的支架模型[12]。传统的相分离法、粒子沥滤法和气体发泡法等方法具有许多优势。但是由于3D打印技术仍在发展之中，其对于材料的应用还有许多的限制。BCP是骨组织工程中最常用的生物陶瓷支架之一，其化学组成与骨组织的无机成分基本相同，作为HA和β-TCP的复合物，具备两者皆有的优点包括骨诱导性和骨传导性，可促进骨细胞的增殖分化，而且HA和β-TCP各自降解方面的缺点也可通过改变其比例来精确调整[13]。CS具有良好的生物相容性、骨引导性和促进骨形成能力等优点[14]，因此其在组织工程等多个领域广泛应用。Abueva等[15]将预制的CS凝胶通过针孔注射与BCP粉末结合，该注射凝胶具有良好的蛋白吸附性与生物相容性，该研究结果为稳定性病理性骨折提供了一种微创骨充填材料。Mooyen等[16]采用CS/胶原蛋白基质与BCP粘合后通过冷冻干燥法制备成复合多孔支架，在体外实验中取得了较好的效果。

本研究采用3D打印技术制备BCP支架，覆盖一层CS膜与其结合。BCP支架的孔径为350～450 μm，BCP/CS支架的孔径为250～300 μm，该结构均可促进组织工程中新生骨和新生血管的形成[17]；肉眼观察2种材料孔隙之间均有良好的连通性，扫描电镜下也证实了支架孔径大小形态规则且连通性良好，有利于细胞在其内部的生长、营养物质的传递及组织的长入等[18]；在吸水性方面，BCP/CS支架的吸水率高于BCP支架，表明其表面的CS膜发挥了良好的亲水性作用[19]。

本研究中，将BCP/CS支架和BCP支架的浸提液与细胞联合培养后，CCK8法检测结果显示：联合培养后2组细胞增殖能力无明显差别，表明该材料具备了生物安全性；将2种支架直接与MC3T3-E1细胞共同培养后，在第1和3天时，BCP/CS和BCP组细胞增殖活性均明显小于空白组，可能由于材料为多孔三维结构，而细胞悬液接种时从孔隙中进入孔板底部，孔板底部经过处理有着亲水性较好的表面，所以进入底部的细胞黏附于孔板，导致了初始黏附在支架上的细胞数量较空白组少[20]。本研究结果显示：与BCP组比较，从第1天开始BCP/CS组细胞增殖活性就处于较高水平，说明材料表面的CS膜较单纯BCP支架具有更好的亲水性；到第5天时，BCP/CS组细胞增殖活性组与空白组比较差异无统计学意义，说明该材料具有促进细胞增殖的能力；当培养到第7天时，BCP/CS组和BCP组的细胞增殖活性均高于空白组，而空白组细胞增殖活性与第5天比较几乎无增加，可能是由于孔板底部是二维结构，细胞长满之后由于接触抑制效应便逐渐停止增殖，而BCP/CS组和BCP组均为三维立体结构，细胞在其表面仍可增殖；第7天时，BCP/CS组细胞增殖活性已经明显高于BCP组，说明BCP/CS复合支架比单纯的BCP支架更能促进细胞的增殖。Castilho等[13]同样使用3D打印技术制备孔径为300 μm的BCP支架，使用聚乳酸-乙醇酸溶液对材料处理后，增强了原材料的细胞增殖水平。

综上所述，采用3D打印制备的BCP支架具备良好的三维立体结构，可促进细胞增殖及营养输送。BCP支架表面覆盖CS后减小了孔径，增大了表面积，使其具有更好的理化性能并促进细胞的黏附增殖。CS本身具有多种可塑性，且已作为载药载体在临床应用，本研究初步验证BCP/CS支架在骨组织工程中的应用潜能，为进一步改进支架和体内实验提供了理论依据。