多囊蛋白1基因对人宫颈癌HeLa细胞的抗凋亡作用

安 乐，杨建征，胡春梅，于 琼，肖 晗，郝书弘，唐 艳

(吉林大学第二医院肿瘤血液科，吉林 长春 130041)

常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是一种常见的单基因遗传病[1-2]。ADPKD主要由PKDl和PKD2基因突变引起,PKD1和PKD2分别编码多囊蛋白1 (polycystin-1，PC1)和多囊蛋白2 (polycystin-1，PC2)。目前研究[3-6]显示：85%～90%的ADPKD与PKD1基因突变有关。

在ADPKD的发病过程中，凋亡信号通路被激活[7-8]，细胞凋亡的增加可引起囊泡的发生[9]，国内外许多研究把干预囊肿上皮细胞凋亡作为重点，从而达到抑制多囊肾囊肿形成的治疗目的。PC1是一个具有长的细胞外氨基末端、 11个跨膜区和短的细胞内羧基末端的跨膜蛋白[10-11]。PC1在MDCK肾细胞中的表达可引起微管的构建并抑制细胞凋亡[12]；PC1抗凋亡的机制目前尚不清楚，参与PC1抑制凋亡的信号途径目前已较明确的是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)等[13-15]。PC1调节蛋白激酶R(PKR)/真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)信号通路及对凋亡影响的研究[15]显示：PC1重组蛋白pEGPF-PC1-5TMC对HEK293T细胞凋亡具有抑制作用。PC1对宫颈癌HeLa细胞是否具有抗凋亡作用目前尚未见报道。本研究选取宫颈癌HeLa细胞作为研究对象，采用MTT法和TUNE法检测PC1对HeLa细胞凋亡的影响,进一步明确PC1的抗凋亡作用,为研究PC1在恶性肿瘤细胞中的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒和试剂 人宫颈癌HeLa细胞为本实验室保存。在含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 mg·L-1链霉素的DMEM高糖培养液中，置于5%CO2、37℃的培养箱中培养。每隔2 ～3 d更换1次培养液，细胞贴壁率达到70% ～80%进行细胞传代。空白对照质粒pEGFP和PC1基因重组质粒pEGFP-PC1-5TMC[15]由陈兴珍博士惠赠。脂质体LipofectamineTM2000 购自美国Invitrogen 公司，MTT和DMSO 购自华美公司，DMEM完全培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司，绿色荧光蛋白(GFP)单抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自鼎国生物公司，化学发光试剂盒购自美国Bio-Rad 公司，TUNEL测试剂盒购自美国Promega公司，硝酸纤维膜购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 转 染 HeLa细胞以2.0×104/孔密度接种6孔板,置于37℃、5% CO2培养箱中培养,48 h后更换新鲜培养液,采用脂质体法转染细胞。用无血清DMEM培养液分别稀释质粒pEGFP、pEGFP-PC1-5TMC和LipofectamineTM2000,室温静置5 min。将2种稀释液轻轻混合,室温放置20 min。将混合液加至对应的孔板中,置于37℃、5% CO2条件下培养。6 h 后更换成新鲜含10%胎牛血清的DMEM完全培养基继续培养。转染空白对照质粒pEGFP组为空白对照组，转染PC1基因重组质粒pEGFP-PC1-5TMC组为转染组。

1.3 Western blotting法鉴定转染细胞 转染后24 h，提取细胞的蛋白,蛋白浓度按Bradford法选择BSA作为测定标准，并根据标准曲线计算样品中蛋白浓度。80 μg蛋白用10%SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维膜上，抗体按照GFP单抗1∶2 000、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 1∶500使用。按照化学发光试剂盒说明书进行杂交。

1.4 MTT 法检测细胞增殖活性 细胞增殖实验分为3组。转染组:转染pEGFP-PC1-5TMC质粒组; 空白对照组:转染pEGFP空白对照质粒组; 正常对照组：未转染的HeLa细胞。转染后24 h，将细胞小心收集并接种到96 孔培养板中,每小孔加入200 μL(相当于1×104个细胞) 细胞悬液。每板设培养基对照和正常对照，每组设定6复孔。分别在24和48 h(转染后48和72 h)采用MTT 法检测细胞吸光度(A)值。将5 g ·L-1MTT 用Dilution Buffer稀释成 1 g·L-1，每小孔加入50 μL MTT，在37℃培养箱中孵育4 h;吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，在平板摇床上摇匀。在酶标仪490 nm波长处检测每孔A值,细胞增殖活性=测量孔A值-培养基对照孔A值。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡率 细胞分别转染pEGFP-PC1-5TMC质粒(转染组)和pEGFP质粒(空白对照组)，转染后48 h，将细胞晾干并经2%多聚甲醛室温固定10 min,PBS洗涤2次，室温置于穿透液(含0.05%Triton X-100 的PBS)中3 min,然后按照TUNEL检测试剂盒进行操作，倒置显微镜观察。凋亡细胞计数:每实验组切片数28个，每个切片取8个阳性视野，每个视野计数200个细胞，细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%，取平均值。

2 结 果

2.1 PC1基因重组质粒转染HeLa细胞株的鉴定 Western blotting法鉴定PC1基因重组质粒转染HeLa细胞株，采用GFP单抗检测，在相对分子质量约68 000处显示 pEGFP-PC1-5TMC蛋白条带。见图1。

Lane 1: Blank control group; Lane 2: Transfection group.

图1 Western blotting法鉴定HeLa细胞中pEGFP-PC1-5TMC表达电泳图

Fig.1 Electrophoregram of pEGFP-PC1-5TMC expressions in HeLa cells identified by Western blotting method

2.2 各组细胞增殖活性 在转染后48和72 h，与正常对照组比较,转染组细胞增殖活性有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组比较，转染组细胞增殖活性明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 转染后48和72 h各组HeLa细胞增殖活性

GroupA value(t/h) 4872Normal control0.762±0.0541.182±0.083Blank control0.629±0.0371.053±0.031Transfection0.727±0.076∗1.154±0.079∗

*P<0.05 compared with blank control group.

2.3 各组细胞凋亡率 TUNEL法结果显示:转染后48 h，转染组和空白对照组均有TUNEL染色阳性细胞，阳性细胞多数皱缩变圆，颗粒感增强，但转染组TUNEL染色阳性细胞数明显少于空白对照组(图2)。转染组细胞凋亡率(4.2%±1.6%)明显低于空白对照组(7.6%±1.7%)(P<0.01)。

A：Blank control group；B：Transfection group.

Fig.2 Apoptosis of HeLa cells in various groups detected by TUNEL assay(×200)

3 讨 论

既往有关PC1抗凋亡作用的研究较少，但已在犬肾上皮MDCK细胞、 人肝癌HepG2细胞及人胚肾HEK293T细胞中证实PC1具有抗凋亡作用[13-15]。

MTT法可以灵敏地检测活细胞数，在生物实验中通常用来测定细胞增殖活性。本研究通过检测细胞转染后48和72 h时细胞增殖情况，了解PC1对细胞凋亡的作用。本研究结果显示：PC1基因过表达有助于维持细胞增殖，提示PC1对HeLa细胞凋亡具有抑制作用。TUNEL法是目前用来检测细胞凋亡的常用方法之一，其优点是灵敏、可靠，目前有关PC1对细胞抑制凋亡作用的研究多采用TUNEL法[13,15]。本研究结果显示: PC1明显抑制细胞凋亡率，表明PC1对HeLa细胞具有抗凋亡作用。

PC1和PC2除了在细胞感应信号转导中发挥重要作用外，还参与多种恶性肿瘤的发病[16-19]，具有较广阔的研究前景。本研究结果不仅进一步证实了PC1具有抗凋亡作用，还为PC1在肿瘤细胞中的抗凋亡机制研究提供了依据。本研究结果符合既往研究已证实的PC1对MDCK、 HepG2和HEK293T细胞有抑制凋亡作用的结论，尤其与PC1对人肝癌HepG2细胞的抗凋亡作用一致，但也有关于PC1能诱导肿瘤细胞HepG2、A549和SW480凋亡的报道[20],因此，PC1在肿瘤细胞凋亡中的作用机制尚有待更多的研究进一步明确。