线粒体靶向KillerRed诱导的ROS增强辐射对HeLa细胞的增殖抑制作用

李 鑫，马云飞，唐 庚，韦 麒，纪红池，田嘉安，申延男，王志成

(吉林大学公共卫生学院 国家卫生健康委员会放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021)

宫颈癌是严重威胁健康与生命的最常见的妇科恶性肿瘤，发展中国家宫颈癌病例数约占全球宫颈癌的85%[1-2]。放射治疗(简称放疗)是宫颈癌常用的治疗手段之一，通过诱导宫颈癌细胞凋亡可以增强其放疗效果。活性氧(reative oxygen species，ROS)是一组高活性的氧分子及其衍生物，在生理条件下，低水平ROS的生成被认为是信号分子，但过量ROS则会诱导氧化损伤，导致肿瘤细胞凋亡或坏死[3-5]。线粒体既是ROS的产生部位，也是ROS的作用靶点。ROS作用线粒体后，可以诱导线粒体损伤，进而导致细胞凋亡。KillerRed(KR)蛋白是一种能够产生红色荧光以二聚体形式存在的蛋白，在540 ～ 580 nm光照时可以产生致细胞损伤的ROS，同时使蛋白失去活性[6-7]。本文作者利用线粒体靶向蛋白选择性雄激素受体调节剂1(selective androgen receptor modulator 1，Sarm1)的线粒体定位序列与KR形成融合蛋白序列，实现线粒体的靶向性，进而诱导ROS大量产生，探讨其联合电离辐射后对HeLa细胞的增殖抑制作用，为宫颈癌的放疗增敏提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人宫颈癌HeLa细胞(本实验室保存)，MEM完全培养基(Gibico公司，美国)，Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂(上海翊圣生物科技有限公司)，青霉素和链霉素(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，ROS测试盒(南京建成生物工程研究所)；CCK-8检测试剂盒(MedChemExpress公司，美国)，Q5 PCR扩增试剂盒(NEB公司，美国)，引物和DNA连接酶(TaKaRa公司，大连)，细胞色素C氧化酶Ⅳ(COX Ⅳ)兔多克隆一抗和抗兔二抗(绿色荧光)(Santa Cruz公司，美国)，其他试剂均为国产分析纯。细胞成像微孔板检测仪Cytation3(Biotek公司，美国)，X射线辐照仪X-RAD 320iX(Precision X-ray Inc 公司，美国)。

1.2 质粒构建在GenBank中查阅小鼠Sarm1基因的线粒体定位序列并设计引物，同时设计KR和mCherry引物(下划线部分为酶切位点)，因KR蛋白光照后失去活性，不适用于荧光观察，因此以mCherry红色荧光代替KR进行线粒体靶向鉴定。Sarm1引物：F (NotⅠ) 5′-AAGGAAAAAAGCGG-CCGCAATGGTCCTGACGCTG-3′，R (EcoR Ⅰ) 5′-CGGAATTCCCGATCGGCGCCCGGCCGTG-3′；mCherry引物：F (EcoRⅠ) 5′-GGAATTC-GCCACCATGGTGAGCAAGGG，R(BamHⅠ)5′-CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-TG-3′；KR引物：F(EcoRⅠ) 5′-GGAATTCATGGGTTCAGAGGGC-3′，R (BamHⅠ) 5′-CGGGATCCCTAGATCTCGTCG-3′。分别以pGw1-myc-Sarm1质粒、plxsp-TetA-mCherry和plxsp-TetA-KR质粒为模板PCR扩增Sarm1、mCherry和KR片段，plxsp-flag空载体行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，将mCherry插入后构建plxsp-flag-mCherry载体,测序鉴定正确后，再进行NotⅠ和EcoRⅠ双酶切，将Sarm1序列插入后构建plxsp-flag-sarm1-mCherry，测序鉴定正确后进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，将KR序列插入后构建plxsp-flag-Sarm1-KR载体，测序进行鉴定。

1.3 实验分组HeLa细胞分为对照组、plxsp-flag组、plxsp-flag-Sarm1-KR组、4 Gy组、plxsp-flag+4 Gy组和plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组。无菌条件下避光采用可见光源照射细胞，时间为10、30和60 min；X射线照射条件：电压 180 kV，电流12.0 mA，靶皮距70 cm，剂量率 1.0 Gy·min-1，单次照射剂量为4 Gy。

1.4 融合蛋白线粒体靶向性鉴定因KR蛋白光照后即丧失活性，产生ROS，不适于进行荧光显微镜观察，以与其氨基酸序列基本一致的红色荧光蛋白mCherry进行线粒体靶向性鉴定。将HeLa细胞按照每孔2×105个细胞接种于铺有盖玻片的6孔板中，待细胞80%融合后将plxsp-flag-Sarm1-mCherry质粒转染HeLa细胞，36 h后取出载玻片进行免疫荧光染色，以COX Ⅳ一抗作为线粒体定位标记(mito-track)，荧光显微镜照相并进行分析。

1.5 ROS生成水平检测HeLa细胞达到80%融合后，0.25%胰酶消化，加入含有10% FBS无抗生素的MEM稀释，按照每孔0.8×104个细胞接种到96孔板中，每孔加入质粒0.2 μg、转染试剂0.2 μL，转染结束后用锡纸包裹96孔板，避光在37℃、5% CO2条件下培养24 h，转染结束后加入完全培养基100 μL，进行可见光照射，分别于照射后10、30和60 min加入DCFH-DA探针标记，并上机检测，以平均荧光强度(mean fluoresencence intensity，MFI) 表示ROS生成水平，实验设6复孔。

1.6 酶标仪检测细胞增殖活性按照每孔0.8×104个细胞接种于96孔板，避光培养于培养箱内，质粒转染后24 h进行可见光照射，12 h后进行4 Gy X射线照射，计为0 h，分别于4、10、24和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，继续培养1.5 h，轻轻震荡后采用酶标仪在450 nm 处检测各孔吸光度[A(450)]值，以A值表示各组细胞增殖活性，实验设6复孔。

2 结 果

2.1 plxsp-flag-KR载体构建PCR扩增获得mCherry、KR和Sarm1产物，长度分别为729、735和108 bp(图1)，经过酶切、DNA连接、产物转化、单克隆挑取、质粒小提和测序(美国Macrogen公司)后，将测序结果与GenBank中序列进行比对，序列完全一致，表明成功构建plxsp-flag-Sarm1-mCherry和plxsp-flag-Sarm1-KR质粒。构建过程见图2。

Lane 1， 6: 100 bp DNA marker; Lane 2,3: mCherry PCR products; Lane 4,5: KR PCR product; Lane 7,8: Sarm1 PCR product.

图1 mCherry、KR和Sarm1 PCR扩增产物电泳图

Fig.1 Electrophoregram of PCR products of mCherry, KR and Sarm1

2.2 融合载体线粒体靶向性鉴定 构建的plxsp-flag-Sarm1-mCherry载体转染HeLa细胞后，在细胞核(DAPI染蓝色)外线粒体部位可见COX Ⅳ蛋白表达(绿色荧光)，而在相同位置可见mCherry蛋白表达(红色荧光)，说明构建的载体能够成功定位于线粒体。见图3(插页一)。

图2 plxsp-flag-Sarm1-mCherry 和plxsp-flag-Sarm1-KR质粒构建示意图

Fig.2 Diagram of construction plxsp-flag-Sarm1-mCherry and plxsp-flag-Sarm1-KR

2.3 可见光照射后各组细胞MFIs 质粒转染后避光培养24 h，对照组和plxsp-flag组可见光照射10、30和60 min后掺入探针，探针掺入10、30和60 min后细胞MFI无明显变化(P>0.05)。可见光照射10和30 min后掺入探针，plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞MFI呈时间依赖性增加；与对照组比较，掺入探针60 min后plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞MFI明显增加(P<0.05)；可见光照射60 min后掺入探针，与对照组比较，掺入探针30和60 min后plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞MFI明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 可见光照射10、30和60 min后各组 HeLa细胞MFI

GroupsProbe incorporation(t/min)MFIVisble right exposure(t/min) 103060Control10862.9±153.8841.8±131.71 062.5±99.630810.3±184.2985.5±10.21 031.9±143.560892.2±87.7983.7±31.8685.8±148.9Plxsp-flag10891.8±146.1874.0±164.91 001.8±179.930804.5±430.31 020.3±13.31 068.0±56.060807.2±58.4985.9±23.1703.2±170.6Plxsp-flag-Sarm1-KR10496.3±235.0975.4±33.5∗785.8±156.4301 007.9±197.81 383.8±197.8971.2±107.7∗601 354.3±276.2∗1 058.3±27.5574.4±36.1∗

*P<0.05vscontrol group.

2.4 各组细胞增殖活性 可见光照射30 min，12 h后行4 Gy X射线照射，与对照组比较，plxsp-flag组细胞增殖活性无明显变化(P>0.05)； plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞增殖活性在10和24 h时明显降低(P<0.05)，4 Gy和plxsp-flag+4 Gy组细胞增殖活性在10 h时明显降低(P<0.01)，plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组细胞增殖活性在10、24和48 h时明显降低(P<0.05或P<0.01)。与plxsp-flag-Sarm1-KR组和4 Gy组比较， plxsp-flag-Sarm1-KR +4 Gy组细胞增殖活性均明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 4 Gy X射线照射后4、10、24和48 h各组细胞增殖活性

GroupProliferation activity (t/h) 4 10 24 48 Control1.000±0.1401.158±0.2011.468±0.0381.550±0.086Plxsp-flag1.027±0.0641.014±0.0901.461±0.1921.560±0.247Plxsp-flag-Sarm1-KR0.706±0.1110.982±0.053∗1.341±0.147∗1.491±0.2694 Gy0.989±0.0570.926±0.201∗∗1.263±0.1411.257±0.060Plxsp-flag+4 Gy0.843±0.0950.818±0.093∗∗1.143±0.1301.235±0.146Plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy0.867±0.1350.879±0.013∗#0.942±0.054∗∗△# 1.118±0.039∗∗△#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vsplxsp-flag-Sarm1-KR group；#P< 0.05vs4 Gy group.

3 讨 论

目前，肿瘤常规的治疗手段包含手术、放疗和化疗。放疗是中晚期宫颈癌患者主要治疗方法，但由于肿瘤对放疗的抵抗和耐受的存在，其效果并不尽如人意。为缓解放疗抵抗，提高放疗效果，放疗增敏剂应运而生，临床医生为增强放射线对肿瘤细胞的杀伤效应，常在放疗时合并使用一些化学药物或采用一些物理方法等，包括化学药物、靶向基因或者传统中药等。基于ROS作用线粒体后可以诱导细胞发生凋亡、自噬和线粒体DNA损伤，外源性ROS也可以作为放疗增敏剂，通过一定的策略增加其产量，诱导肿瘤细胞凋亡，更有效地提高放疗的疗效[8-12]。诱导ROS产生也是肿瘤光动力治疗(photodymamic therapy，PDT)的基本原理，即利用光敏剂在可见光的照射下，导致ROS的产生，继而作用于细胞，产生细胞杀伤。因此，肿瘤的PDT与放疗联合应用将具有良好的前景。

ROS是一类化学性质活泼，具有较高氧化活性的分子或离子，过量的ROS会对蛋白质、核酸和脂质等生物大分子造成损伤，从而影响其正常生理生化功能。ROS作用于线粒体后，损害线粒体的完整性，诱使蛋白修饰，引起脂质过氧化和线粒体DNA(mtDNA)的损伤，可能导致膜去极化，电位耗散，引起细胞线粒体内细胞色素c(Cyt c)、凋亡诱导因子(AIF)和Smac等促凋亡蛋白释放，诱导细胞凋亡[13]。同时，线粒体激酶Pink(PTEN-induced putative kinase)将帕金蛋白(parkin)募集到线粒体外膜上，启动线粒体自噬，引发选择性自噬途径[14-15]。这是ROS诱导细胞死亡的重要机制。

红色荧光蛋白KR以二聚体形式存在，最大激发/发射波长为585/610 nm，既可以直接在靶细胞内单独表达，也可以与靶蛋白融合表达，其蛋白中存在一个长的水通道结构，在540 ～ 580 nm的光照时可以产生致细胞损伤的ROS，一般为超氧阴离子和过氧化氢(H2O2)，同时蛋白失去活性[7, 16]。利用红色荧光蛋白KR进行相关ROS诱导的研究中，主要利用其在激光照射下可以产生1 000倍于GFP照射产生的ROS，具有“爆发式”特点，使其发挥足量的作用。Sun等[17]用KR成功地靶向定标制造基因损伤(DART系统)，这种在特定基因位点引入损伤的系统，近年来为相关领域发展起到了助推作用。基于此理论，本文作者设想将线粒体靶向蛋白Sarm1序列克隆到KR蛋白序列的前面，构建融合蛋白表达载体，结果显示：构建的融合表达载体具有线粒体靶向特性。本研究同时显示：利用可见光照射可以诱导HeLa细胞内ROS产生，在可见光照射30 min后为ROS产生提供比较理想的条件。

本研究在上述诱导ROS产生的基础上，进一步给予4 Gy X射线照射，观察其对细胞增殖的影响，结果显示：转染了plxsp-flag-Sarm1-KR质粒的HeLa细胞在可见光照射后细胞增殖活性较对照组明显降低，各组细胞经4 Gy X射线照射后增殖活性也明显降低，且plxsp-flag-Sarm1-KR + 4 Gy组较plxsp-flag-Sarm1-KR组和4 Gy组细胞增殖活性进一步降低，说明可见光诱导ROS导致了细胞死亡，细胞增殖活性降低，且增强辐射诱导的细胞增殖抑制作用。本研究基于Sarm1线粒体靶向信号序列能够实现线粒体基质靶向，而KR蛋白在光照下能够失活，且诱导ROS“爆发式”产生，ROS的质和量都得到了保障[18]。因此，将融合表达质粒转染肿瘤细胞，使线粒体靶向的融合蛋白既能实现线粒体靶向，又能光照后产生大量ROS，使得肿瘤细胞在进行放疗前部分细胞死亡，再进行放射治疗，增进放疗对肿瘤细胞的杀伤效果。