两种低氧性肺动脉高压小鼠模型的建立与比较

高 阳 刘 杰 王 蕾 张 炜 刘亚飞 齐先梅 王 望，3*

(1.首都医科大学基础医学院，北京 100069；2.首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京 100069；3.北京市呼吸和肺循环疾病重点实验室，北京 100020)

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension， PAH)是一种以肺小动脉异常收缩以及重构为病理特征的一组临床综合征，最终导致右心室衰竭甚至死亡[1-2]。PAH的病理机制为肺小动脉内皮细胞损伤，功能紊乱，致使内皮细胞、平滑肌细胞异常增生，甚至形成新生内膜、丛状坏死区[2-4]。至今，肺动脉高压的发病机制并不完全清楚，可靠的动物模型有助于其研究。目前制备肺动脉高压的动物模型有外科手术建立分流术、野百合碱注射、低氧诱导等方法[5]，但这些模型尚不能完全模拟肺动脉高压患者的肺血管病变[6]。因此，为了深入研究肺动脉高压病理生理特点及其发病机制，建立切合临床发病机制的动物实验模型尤为重要。

目前，单纯低氧诱导肺动脉高压动物模型，是肺动脉高压研究中应用广泛的模型之一，源于其良好的重现性和易于描述的组织病理学特点[5，7]。该动物模型，主要通过低氧条件刺激肺小动脉中膜平滑肌增生，血管基质沉积，引起一系列病理改变[8]，接近肺动脉高压发病的自然病理过程[9]。但是，肺动脉高压病因十分复杂，这种造模方法并不能完全模拟人类肺动脉高压的病理特征。因此急需一种更理想的造模方法来模拟人类肺动脉高压[1]。

SU5416{Z-3[(2，4-二甲基吡硌-5-羟基)亚甲基]-2-吲哚满酮}，是一种脂溶性小分子血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)信号转导抑制剂[8]，能够抑制血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)，造成内皮细胞死亡[10]。已有研究[11-16]表明：低氧联合SU5416诱导大鼠，能够较好地模拟肺血管新生内膜和丛状病变。其机制可能与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)和低氧刺激有关。VEGF维持肺血管内皮细胞存活[17]，SU5416通过抑制VEGFR干扰VEGF发挥作用，导致肺血管内皮细胞功能障碍，启动天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)，继而激活细胞内B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)过度表达，使肺血管壁内皮细胞产生抗凋亡性，形成凋亡抵抗状态[8]。在低氧环境持续刺激下，致使具有抗凋亡的内皮细胞过度增生，参与肺血管重构，进而形成肺动脉高压[18]。

因此，本实验利用低氧联合SU5416建立肺动脉高压小鼠模型，且与单纯低氧诱导的肺动脉高压模型进行比较并分析，探索低氧联合SU5416能否建立更显著的肺动脉高压小鼠模型，更大程度模拟肺动脉高压患者的临床病理生理特点，为低氧性肺动脉高压发病机制的阐明和治疗靶点的研究提供了理论依据和实验基础，有助于肺动脉高压的深入研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取15只6～8周龄雄性C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0011]，体质量18～25 g，采用数字表法随机分为3组(每组5只)：常氧组、单纯低氧组、低氧联合SU5416组。肺动脉高压小鼠模型建立，如图1，低氧组小鼠置于常压低氧箱内，氧气浓度10%(体积分数)，每天持续低氧，共计4周，每周更换垫料、水、食物3次；低氧联合SU5416组，将SU5416溶于溶剂DMSO中，给予SU5416(20 mg/kg)腹腔注射，每周2次；单纯低氧组，与低氧联合SU5416组同一时间点给予同等剂量DMSO腹腔注射；常氧组，置于同一房间内，常压常氧环境饲养4周，饲养条件保持基本相同。

图1 实验方案Fig.1 Experimental setup

Male C57BL/6 mice were injected subcutaneously twice a week with SU5416 (20 mg/kg) or DMSO combined with exposure to hypoxic environment for four weeks. Normoxia was used as control.

1.2 主要试剂及系统

SU5416购自美国Sigma公司(将SU5416溶于DMSO溶液，调整其终浓度为4g/L)，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 实验方法

1)右心室收缩压、右心室肥厚指数和右心室/体质量比值的检测：在实验进行4周后，称量各组小鼠体质量(body weight， BW)，将各组实验小鼠腹腔注射2%(质量分数)戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行麻醉，采用闭胸右心室穿刺法检测其右心室收缩压(right ventricular systolic pressure， RVSP)。随后分离出小鼠心脏，剪去心耳，再沿室间隔剪下右心室，用滤纸吸去其水分，分别称量右心室(right ventricle， RV)、左心室+室间隔(left ventricle plus interventricular septum， LV+S)的质量，最后计算右心室肥厚指数(the index of right ventricular hypertrophy， RVHI=RV/(LV+S)×100%)和右心室/体质量比值(right ventricle/body weight， RV/BW)。

2)肺小动脉形态学观察：将各实验组小鼠分离出左肺组织，利用0.9%(质量分数)氯化钠注射液冲洗干净，再固定于4%(体积分数)中性甲醛溶液中，然后依次进行梯度乙醇脱水，石蜡包埋，做4 μm/张的连续切片，进行HE染色，最后在光镜(200×)下观察肺小动脉变化，并利用NIS-Elements显微图像处理软件测量各小组动物肺小动脉(直径为0～100 μm)管壁的血管外周长(中膜以内)和血管腔周长(内膜表面以内)，计算血管壁中膜厚度占血管外径百分比(medial thickness， MT%)，依据公式[19]：①中膜厚度=血管外周长/2π-血管腔周长/2π；②MT%=(中膜厚度×2)/(血管外周长/π)×100%；计算肺小动脉血管内径(vessel diameter， VD)、血管外径(external diameter， ED)和MT%(MT%= (ED-VD)/ED×100%)，按照ED分为0～5 μm、26～50 μm、51～75 μm、76～100 μm 4组，并进行统计分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两种造模方法中小鼠体质量的变化

如表1所示，0周时，各组小鼠体质量间差异无统计学意义(P>0.05)，从0周到4周，3组小鼠体质量均随时间增加而增加(P<0.05)。4周时，单纯低氧组和低氧联合SU5416组，与常氧组相比，其体质量低于常氧组，差异有统计学意义(P<0.01)，但低氧联合SU5416组与单纯低氧组体质量之间差异无统计学意义(P>0.05)。与正常环境饲养的小鼠相比，低氧环境中小鼠体质量有明显减轻。

表1 各组小鼠体质量比较Tab.1 Comparison of mouse body weightamong three groups

**P<0.01vsnormoxia (4 weeks);n=5.

2.2 两种造模方法中RVSP、RVHI、RV/BW的比较

4周时，常氧组小鼠RVSP为(20.14±1.19)mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)，单纯低氧组高达(25.46±0.89)mmHg，比常氧组高(26.42±7.99)% (P<0.01)，而低氧联合SU5416组更是达到(29.94±1.14)mmHg，与单纯低氧组相比，高于该组(17.59±11.43)% (P<0.05)。低氧联合SU5416小鼠的RVSP显著高于单纯低氧组，建立肺动脉压力更高的小鼠模型(图2A)。

图2 各组小鼠RVSP、RVHI及RV/BW 的比较Fig.2 Comparison of RVSP，RVHI，RV/BW among three groups

*P<0.05;**P<0.01 ；***P<0.001;n=5;△1 mmHg=0.133kPa；A: RVSP;B: RVHI;C: RV/BW;RVSP: right ventricular systolic pressure;RVHI: index of right ventricular hypertrophy;RV/BW: right ventricular/body weight.

本实验用RVHI和RV/BW反映小鼠右心室肥厚程度。4周时，常氧组小鼠RVHI为(19.00±0.54)%，单纯低氧组小鼠RVHI增长到了(23.32±1.77)%，高于常氧组(22.73±17.19)%(P<0.05)。低氧联合SU5416组更是达到了(30.23±0.58)%，与单纯低氧组相比，该组小鼠的RVHI增长(29.63±5.80)% (P<0.01)(图2B)。

4周时，常氧组小鼠的RV/BW为(7.37±0.15)%，单纯低氧组为(8.95±0.54)%，低氧联合SU5416组达到(9.96±0.10)%，各组之间进行比较：单纯低氧组小鼠RV/BW较常氧组高(21.37±12.95)% (P<0.05)。低氧联合SU5416组小鼠RV/BW更是高于常氧组(35.15±3.94)%(P<0.001)。而低氧联合SU5416组小鼠的RV/BW与单纯低氧组之间差异无统计学意义(P>0.05)(图2C)。低氧联合SU5416小鼠的右心室比单纯低氧组小鼠的右心室肥厚更加显著。

2.3 两种造模方法中肺小动脉形态学比较

肺动脉高压血管重构主要发生于肺小动脉血管壁中膜，故本实验用血管壁中膜厚度占血管外径百分比(MT%)作为衡量肺血管重构的指标。4周时，常氧组小鼠肺小动脉管壁薄，结构清晰，形态和管腔正常；单纯低氧组小鼠肺小动脉管壁较常氧组明显增厚，且管腔变狭窄；与单纯低氧组相比，低氧联合SU5416组小鼠肺小动脉管壁增厚程度更加严重，管腔变得更为狭窄(图3)。

图3 各组小鼠肺组织HE染色Fig.3 Sections of the lungs were stained with HE staining

Medial wall thickness of small pulmonary arteries in three groups.Scalebar: 50 μm. The frame indicates distal pulmonary arteries.

根据各组小鼠肺小动脉血管外径大小，将其分为4组，依次为0～25 μm，26～50 μm， 51～75 μm， 76～100 μm， 通过检测各个级别血管的中膜厚度百分比，得出常氧组的MT%依次为(22.77±1.35)%、(21.63±1.13)%、(15.86±0.81)%、(16.45±1.08)%；而单纯低氧组MT%更高，依次达到(35.92±2.11)%、(27.33±0.55)%、(22.94±1.03)%、(17.29±0.91)%，且在外径分为0～25 μm， 26～50 μm， 51～75 μm三个级别肺动脉血管中，显著高于常氧组；与单纯低氧组MT%相比，低氧联合SU5416组在4个级别肺血管MT%均显著增加，更是达到(44.08±1.64)%、(36.59±1.41)%、(25.70±0.85)%、(20.80±1.37)%(图4)。通过肺小动脉形态学的比较得出，低氧联合SU5416组的肺小血管重构比单纯低氧组更严重。

3 讨论

图4 各组小鼠MT%的比较Fig.4 Comparison of MT% of smallpulmonary arteries among different groups

*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;n=15-20/group;MT: media thickness.

本实验将小鼠随机分为常氧组、单纯低氧组以及低氧联合SU5416组，进行4周实验，结果显示低氧联合SU5416组表现出显著的肺动脉高压特点：低氧联合SU5416组的RVSP、RVHI、MT%均高于单纯低氧组，且其肺小血管较单纯低氧组重构更明显，管腔更狭窄。此造模方法比单纯低氧诱导方法建立更为显著的肺动脉高压小鼠模型。

单纯低氧诱导肺动脉高压模型，最主要的病理生理特点是肺血管收缩和重构。在低氧环境刺激下，肺小动脉血管持续性反复收缩，导致肺血管发生重构，使得各级肺血管管壁增厚和超微结构改变，肺循环外周阻力增加，肺动脉压力进行性升高，致使右心室肥厚，恶性循环形成肺动脉高压[20-21]。所以该动物模型能够模拟一般肺动脉高压患者的病理特征。

低氧联合SU5416模型，VEGF维持肺血管内皮细胞正常生理功能，SU5416通过抑制VEGFR，破坏肺血管内皮细胞正常生理，使得Caspase-3上调，Caspase是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，可致使内皮细胞凋亡性死亡，同时细胞内Bcl-2过度表达，该基因是一种原癌基因，具有抑制细胞凋亡的作用，其使肺血管壁内皮细胞产生抗凋亡性，形成凋亡抵抗状态，产生抗凋亡性的内皮细胞，在低氧环境刺激下，内皮细胞异常增生。平滑肌细胞，也因受低氧刺激，其内活性氧水平升高，激活缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)基因转录和上游基因表达，促进HIF-1α表达，进而使VEGF转录增强，肺小动脉内皮细胞表面VEGF和其受体表达增加[8]。同时引起肺小血管处募集炎性细胞，诱导促炎性反应因子白细胞介素-6(interleukin-6 receptor，IL-6)大量表达，也刺激内皮细胞增生，上调血管平滑肌VEGFR-2，内皮细胞大量产生内皮素-1(endothelin-1， ET-1)，且平滑肌细胞内皮素受体A(ETRA)增加，进而促进平滑肌细胞过度增生，形成肺部小血管病变，导致肺动脉高压。

低氧联合SU5416造模方法，近年来应用于肺动脉高压动物模型的研究，在大鼠造模方面有明显效果。研究[16]表明，单次注射，低氧环境3周可以建立显著的肺动脉高压模型，甚至模拟出人类严重肺动脉高压特征即丛状病变[22]。但此模型在小鼠上未达成共识。有研究者[23]在SV129小鼠上成功建立起重度肺动脉高压模型，模拟出临床重度肺动脉高压特点：新生内膜、丛状病变、募集巨噬细胞、肺小动脉肌化。也有研究者[24]成功用C57BL/6小鼠建立严重肺动脉高压模型，但亦有研究者[10，25]未能建立该模型。据此推测，可能是不同种系小鼠对低氧、SU5416的影响和反应程度不同，导致肺部病变发展速度不同。C57BL/6小鼠可能对低氧联合SU5416诱导肺动脉高压有较高的抵抗力。

本实验选择C57BL/6小鼠进行实验，该品系是实验研究中的常用小鼠。鉴于以前的研究[10]，小鼠一般在低氧环境[9%～10%(体积分数)氧气]饲养3周，最多每只小鼠注射SU5416(20 mg/kg)达到6次，在本实验中，延长低氧时间，达到4周，并保持SU5416(20 mg/kg)注射频率，处死前，每只小鼠达到了注射该试剂8次，以达到成功模拟更为显著的肺动脉高压，甚至严重肺动脉高压的目的。

总之，低氧联合SU5416处理C57BL/6小鼠，能够模拟出更为显著的肺动脉高压模型。但该模型能否模拟出严重肺动脉高压，本实验无从判断。虽然未在HE染色的肺小血管中观察到明显的丛状病变，但笔者未利用双荧光染色、免疫组织化学等方法检测肺小血管新生内膜状况、血管壁肌化程度等严重肺动脉高压病变特点。也有可能与SU5416注射频率、注射剂量不足有关。这有待于后续研究，才能判断低氧联合SU5416能否在C57BL/6品系小鼠上建立严重肺动脉高压模型。