缺氧及缺氧再复氧对正常骨组织发生与发展的影响

王 欢，董 川，李 彬，王 伟，王 璞，马 琼，文艳华，刘云燕，马保安

(1.空军军医大学唐都医院骨科，陕西 西安 710038；2.解放军联勤保障部队第941医院，青海 西宁 810007)

我国高原地区有其独特的地势地貌和气候特点，其中低压低氧环境对人类的健康有一定影响，不仅可以直接影响机体功能状态，而且在机体受负荷刺激后，不同的地理环境因其气压等差异将产生不同的效应[1]，如呼吸加快、心率增快、红细胞增多(血液黏滞性增加)等，同时也会出现消化系统、泌尿系统以及认知、记忆功能的减退，甚至发生高原相关疾病[2-6]。骨质疏松症是一种多因素造成的慢性疾病[7-8]。目前的流行病学调查发现，高原地区人群骨质疏松症发生率显著高于平原地区，可能的影响因素包括氧气浓度、日照、性别、年龄、体重、饮食习惯及基础疾病等，其中氧气浓度对于骨代谢的影响最为显著[9-10]。高原低氧环境是否对骨组织有明确的影响，目前仍存在争议。本研究通过观察低氧与常氧环境中小鼠骨组织发生及发展是否存在差异，以及复氧能否改善低氧对骨组织的不良影响，进一步明确缺氧与骨质疏松之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性C57小鼠40只，体重16.5～24 g，由空军军医大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(陕)2020-007。随机分为常氧组(16只)、低氧组(16只)、及低氧转常氧组(8只)。分笼饲养于实验动物中心SPF动物房及低压低氧舱，每笼4只，自由摄食、饮水，温度22～26 ℃，湿度55%～65%，光照时间按照12 h间隔。

1.2 实验主要设备和软件 低压低氧模拟实验舱(中国贵州风雷航空军械有限公司)；SysmexXE-2100全自动血细胞分析仪(日本SYSME东亚公司)；Micro-CT(GE)；生物力学试验机(西安交通大学航空航天工程学院机械结构强度与振动国家重点实验室)；图形分析软件(美国Autodesk公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)；复合光学显微镜及照相系统(日本Olympas公司)。

1.3 动物模型制作及实验流程 常氧组和低氧组分别饲养于常氧和低氧环境8周，而低氧转常氧组于低氧环境饲养4周后转至常氧环境饲养4周。三组小鼠前3 d分别置于动物饲养室及低压低氧舱(正常大气压)内喂养以适应环境。第4天开始实验，低压低氧舱开始降压，舱内空气压力设置为61.64 kPa，模拟海拔4000 m的大气压，氧分压12.91 kPa，定期开仓投喂。常氧组仍于动物房内正常大气压下喂养。于4周和8周行心尖取血后将双侧股骨分离取出，右侧先后行micro-CT及HE染色，左侧行三点弯曲试验。

1.4 血液学检查 小鼠麻醉后由低压低氧舱和动物饲养房移至手术室在心尖取血，标本收集后立即送至西京医院门诊检验科检测血常规。

1.5 micro-CT检测 小鼠断颈处死后，取右侧股骨置于福尔马林溶液中-4 ℃保存。标本收集后统一行micro-CT检测[11-12]。扫描参数：分辨率8 μm，球管电流80 mA，球管电压80 kV，曝光时间3000 ms。扫描完成后，选取距离股骨远端生长板1 mm处开始向近端高度2 mm范围为感兴趣区域行三维重建，使用Explore Reconstruction软件进行重建定量分析[13]，检测相对骨体积(BV/TV)、相对骨表面积(BS/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)[10]。

1.6 组织学观察 将多聚甲醛固定后的右侧股骨标本流水冲洗24 h，经10% EDTA脱钙14 d，常规逐级酒精脱水、二甲苯透明、石蜡浸润及包埋。用切片机5 μm连续切片，二甲苯脱蜡，HE染色，光镜下观察骨小梁分布以及面积、长度、厚度等[14]。

1.7 生物力学检测 将在70%湿盐水中保存的左侧股骨用纱布擦干水分[15]。将股骨标本放置在生物力学实验机上，实验台跨距6 mm，加载速率0.005 mm/s。在加载负荷过程中，机器实时记录下载荷与位移参数，直到股骨发生断裂。比较两组生物力学性能[16-17]。

1.8 统计学方法 应用SPSS 17.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，两样本均数比较用t检验，多样本均数比较用方差分析，三组间两两比较采用Newman-Keuls法(q检验)， 多样本间两两比较涉及重复测量时用Bonferroni校正。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组小鼠体重及体重增量比较 见表1。各组小鼠在实验前体重比较无统计学差异(P>0.05)。4周时低氧组与低氧转常氧组小鼠体重及体重增量比较无统计学差异(均P>0.05)，但均低于常氧组(均P<0.05)。8周时三组小鼠体重比较无统计学差异(P>0.05)；常氧组与低氧转常氧组体重增量比较无统计学差异(P>0.05)，但均高于低氧组(均P<0.05)。

表1 各组小鼠体重及体重增量比较(g)

2.2 三组小鼠血常规比较 见表2。4周时，低氧组红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)及红细胞压积(HCT)均高于常氧组(均P<0.05)。8周时，低氧组RBC、Hb、HCT均高于常氧组和低氧转常氧组(均P<0.05)，而常氧组与低氧转常氧组上述指标比较均无统计学差异(均P>0.05)。

表2 三组小鼠血常规比较

2.3 三组小鼠4周及8周时微观结构比较 见表3(图1)。micro-CT三维重建结果显示，4周时低氧组骨小梁出现断裂、变短、网状结构退化，空隙较大；常氧组骨小梁较粗，空隙较小，数量较多，连续性较好。8周时低氧组骨小梁断裂、退化明显，空隙明显；低氧转常氧组骨小梁空隙小且均匀，连续性较好。各参数量化分析结果显示，4周时低氧组BV/TV、Tb.Th、Tb.N均低于常氧组，BS/TV高于常氧组(均P<0.05)；8周时低氧组BV/TV、Tb.Th、Tb.N均低于常氧组和低氧转常氧组，BS/TV高于常氧组与低氧转常氧组(均P<0.05)，而常氧组与低氧转常氧组比较均无统计学差异(均P>0.05)。

表3 三组小鼠4周及8周时微观结构指标比较

图1 各组小鼠股骨干骺段4周(A)及8周(B)时二维平面及三维重建图

2.4 三组小鼠股骨远端HE染色结果比较 见图2。标本均选择股骨远端靠近生长板处的松质骨进行观察。4周时，可见低氧组骨小梁相对稀疏，常氧组骨小梁较为丰富。8周时，低氧组较常氧组和低氧转常氧组明显疏松，但常氧组与低氧转常氧组无明显差异。

图2 三组小鼠股骨远端4周(A)、8周(B)时HE染色结果

2.5 三组小鼠4周及8周时生物力学指标比较 见表4。4周时，低氧组股骨干最大力、刚度、最大应力以及杨氏模量均低于常氧组(均P<0.05)。8周时，低氧组股骨干最大力、刚度、最大应力以及杨氏模量均低于常氧组和低氧转常氧组(均P<0.05)，但常氧组与低氧转常氧组比较均无统计学差异(均P>0.05)。

表4 三组小鼠4周及8周时生物力学指标比较

3 讨 论

高原环境是一个复杂的复合环境，其中低大气压、低氧、低温、低湿、强太阳辐射等因素往往综合作用于人体，对身体机能、消化系统、循环系统、泌尿系统、大脑功能(记忆和认知)等有明显的影响。目前认为低压低氧是其中重要且对机体影响较大的因素[18-19]，对骨发生及骨愈合的影响也不乏报道。

本研究着重观察高原低压低氧环境对小鼠正常骨发生、发展的影响，发现小鼠在缺氧环境较常氧环境中增长缓慢，红细胞增多(血液黏滞性增加)，符合高原缺氧环境的表现。较低的体重被认为是降低氧耗量的适应性改变，而增多的红细胞从另一方面增加了血液的携氧能力，从而保证机体更好地适应低氧环境，这一结果与文献报道[20-22]一致。低氧环境小鼠股骨远端松质骨较常氧环境骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量显著减少，骨表面积和组织体积比显著增加，说明低氧环境中正常骨组织发生了微观结构的改变，出现了骨质流失，倾向于发生骨质疏松，从而增加了发生骨折的风险。生物力学测试则说明了低氧环境中小鼠骨骼机械性能同时受损，其产生可能涉及多种机制。骨组织的正常发生、发展有赖于正常氧分压下的局部微环境，当体内组织氧分压下降，组织内的血管形成及细胞外基质沉积均会减弱，往往会影响骨组织的强度和质量。特别重要的是，低氧环境中的小鼠复氧后表现出了骨骼结构和功能的改善和恢复，与常氧环境无显著差异，说明骨组织的发展很大程度上依赖于骨组织局部微环境中的氧分压，而氧分压的改变会影响多种骨细胞的相互作用，宏观上表现为骨组织结构功能的改变。本研究选取小鼠股骨进行了micro-CT、HE染色和三点弯曲试验等，结果提示在模拟高原低压低氧的环境下小鼠正常骨组织的微观结构和宏观功能受到不同程度的影响，存在发展为骨质疏松的可能性，其产生可能涉及多种机制，复氧对骨骼结构和功能的恢复具有一定作用。

骨的发生、发展是一个动态平衡的过程，由成骨细胞、破骨细胞、骨髓间充质干细胞及骨髓腔内微环境共同完成。低氧环境下人体血氧浓度下降，骨髓腔内氧浓度也受到明显影响。在此微环境的变化下，成骨细胞、破骨细胞及骨髓间充质细胞的代谢必然受到影响[23-25]。低氧环境下各种细胞因子与炎性介质的释放打破了成骨与破骨的动态平衡，综合因素下造成骨质流失[26-27]。本研究还发现在经过短期低氧环境已造成骨流失的情况下，复氧对于骨组织恢复正常的结构和功能尤为重要。因此，对于高原短期工作或任务人群，制定合理的高原环境中作业时间并及时有效地降高复氧对维持骨组织正常的平衡和保护原有的结构和功能具有重要意义。