球周注射尼莫地平对兔慢性高眼压致视网膜神经节细胞凋亡的干预作用

黄帅，张新跃，张雅馨，刘颖，李琰，周亚男，王林洪

（华北理工大学附属医院 眼科，河北 唐山 063000）

青光眼是继白内障之后的第二大致盲性疾病，研究显示全球青光眼患病量在2040年将达11 180万[1]。青光眼的视神经损害主要表现在视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell, RGC）的凋亡，多种研究显示青光眼的发病类似于老年痴呆、帕金森等中枢退行疾病，首先病变可能起始于中脑上丘，进一步发展至RGCs，最终引起1个投射单位的凋亡[2-3]。因此，刘光旭等[4]认为青光眼属于中枢神经系统疾病，在降眼压的同时，对视神经的保护成为治疗重点。众所周知，钙通道阻滞剂（calcium channel blockers, CCB）作为中枢神经保护药物应用临床已有多年[3]，与其他CCBs相比尼莫地平（nimodipine, NMD）具有高脂溶性，可以轻易跨过血-脑屏障，对中枢神经系统具有较高亲和力，能阻断钙离子内流，保护神经元[5]。但相关研究显示，尼莫地平口服给药生物利用率相对较低，只有4%～13%[6]。在神经外科，较多学者通过大量动物实验及毒理实验证实局部给药是安全有效的，支持NMD通过蛛网膜下腔[7]、脑室[8]及皮下注射等[9]途径给药，认为局部给药即可避免全身给药的低血压等并发症，也可在局部达到有效的药物浓度，提高治疗效果[7-9]。本研究拟通过尼莫地平注射液球周注射的方法，进一步评估尼莫地平局部高浓度对慢性高眼压兔视网膜损伤的保护作用，及局部注射对眼外肌等眶内组织的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康新西兰白兔30只（由华北理工大学动物实验中心提供），体重2～2.5 kg，雄性，普通级实验动物，外眼及眼底无异常。适用性喂养1周，随机分成5组，每组6只，右眼为实验眼，实验前3 d开始点抗生素滴眼液，每日3次。

1.2 主要实验材料

卡波姆940（美国诺誉），Tono-pen AVIA眼压计（美国Mentor公司），B淋巴细胞瘤2基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、B淋巴细胞瘤2基因相关蛋白X（BCL2-Associated X, Bax）兔单克隆抗体/免疫组织化学（简称免疫组化）试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），TUNEL试剂盒（美国ROCHE药业），尼莫地平注射液（尼膜同，德国拜耳医疗）。

1.3 方法

1.3.1 制备卡波姆溶液 卡波姆及地塞米松注射液溶入无菌注射用水中，配置成3 g/L复方卡波姆（含地塞米松0.25 g/L）。

1.3.2 复制慢性青光眼模型 A组为正常组不做任何处理。其余放入兔盒内限制自由活动，双眼点表面麻醉药2次，间隔3 min。眼压计连续测量3次，取平均值，计兔基础眼压。采用“隧道”法复制慢性青光眼模型即：5 ml注射器针头，自右眼11点方向角膜缘后1 mm处进针，角度约15°，角膜缘层间走行约1～2 mm自透明角膜进入前房，待针头尾端可见前房液时，退出5 ml注射器针头，泪道冲洗针头自穿刺口进入前房瞳孔区，缓慢推注0.2 ml卡波姆溶液。术眼滴入1滴洛美沙星眼用凝胶。注入后逐渐出现球结膜充血，角膜雾状混浊，术后3 h测量眼压，均超过2.93 kPa，可见前房轻度加深，瞳孔竖椭圆形。第1周每日测量眼压，以后每3～4天测量眼压1次。慢性高眼压模型眼压维持在2.93～6.67 kPa。对眼压低于2.93 kPa者给予补充卡波姆溶液0.1 ml。B组为对照组，给予生理盐水1 ml球周注射，C、D、E为NMD低、中、高剂量组，分别球周注射NMD注射液0.25 ml（0.125 mg）+生理盐水0.75 ml和0.5 ml（0.25mg）+生理盐水0.5 ml及1 ml（0.5 mg），每日 1 次。

1.4 标本的制备

每组于治疗2周时处死动物，100 g/L水合氯醛耳缘静脉麻醉，右眼点丙美卡因滴眼液2次，迅速取材，分离眼外肌，摘取眼球，40 g/L多聚甲醛中固定30 min，自角膜缘剪去角膜，去除晶状体，继续固定24 h以上；将眼球壁自视乳头处纵向切开，于距视乳头旁0.3 cm以外，沿视神经水平和垂直方向各取约1.0 cm×0.5 cm的视网膜组织。均放入包埋盒中，经脱水、透明、石蜡包埋、切片，分别行HE染色、TUNEL检测及免疫组化检测Bcl-2、Bax表达量。

应用相关试剂盒说明操作，放置显微镜下计数，计数方法：每只眼球随机选取2个200倍视野，计数阳性细胞数及总细胞数，计算阳性表达率。阳性表达率=阳性细胞数/细胞总数×100%。视网膜神经节细胞凋亡指数按照TUNEL试剂盒说明操作，凋亡细胞的细胞核呈棕色或棕褐色，放置显微镜下计数，计数方法同上，计算凋亡指数，凋亡指数=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，所得数据行满足方差分析条件（正态分布/方差齐性）的检验。多组间采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonfereoni校正的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

复方卡波姆溶液注入兔前房，兔眼压逐渐升高，在3 h及达到2.93 kPa，约于第3天达到峰值，可以维持在2.93 kPa以上2周。剔除眼压超过50 mmHg、角膜扩张等未完成实验者。

2.1 各组视网膜病理切片情况

A组（正常组）可见视网膜各层次清晰，细胞核排列紧密。B组（对照组）可见视网膜水肿，神经节细胞数量减少，内外核层排列疏松、紊乱。治疗组C、D、E组上述改变较B组减轻，以D、E组损伤最轻。见图1。

2. 2 Bcl-2蛋白表达

视网膜可见Bcl-2表达于细胞浆，染色呈黄色或棕黄色，主要位于RGCs层及内核层。正常视网膜无Bcl-2阳性表达A组（见图2A）。在B、C组（见图2B、2C）呈低表达，在D、E两组（见图2D、2E）呈高表达。

2.3 Bax蛋白表达

Bax阳性表达于细胞浆，颜色呈黄色或棕黄色。Bax在A组（见图3A）正常视网膜无Bax阳性表达。在B、C两组（见图3B、3C）呈高表达，随着NMD剂量增高阳性细胞表达量降低，在D、E两组（见图3D、3E）呈低表达，随着NMD剂量的增加，Bax表达量逐渐减缓。

图1 各组视网膜病理切片 （HE×50 μm）

图2 各组视网膜Bcl-2表达 （50μm）

图3 各组视网膜Bax表达 （50μm）

2.4 视网膜神经细胞凋亡指数

按照TUNEL试剂盒说明书操作，阳性细胞主要表达于细胞核，染色呈棕色或棕褐色。在正常视网膜无阳性细胞表达A组（见图4A）。在B、C两组（见图4B、4C）呈高表达，在D、E组（见图4D、4E）呈低表达。NMD可降低细胞凋亡TUNEL检测的表达量，在NMD 0.25 mg时达最低表达点，结果与Bax表达量相符。见附表。

图4 各组视网膜神经节细胞凋亡 （50μm）

附表 视网膜凋亡相关因子及神经细胞凋亡指数比较 （n=6，±s）

附表 视网膜凋亡相关因子及神经细胞凋亡指数比较 （n=6，±s）

注：1）与B组比较，P＜0.05；2）与C组比较，P＜0.05；3）与D组比较，P＜0.05

组别 Bcl-2/% Bax/% Bcl-2/Bax 神经细胞凋亡指数/%A 组 0.227±0.411 0.606±0.707 0.333±0.188 0.303±0.447 B 组 8.257±1.253 18.560±1.955 0.451±0.093 17.954±1.556 C组 9.545±1.4241）18.905±1.781 0.521±0.085 16.893±1.3681）D 组 18.257±1.4221）2）11.075±1.1271）2）1.833±0.2571）2）9.696±0.9751）2）E 组 19.621±1.8371）2）3）9.015±0.9051）2）2.196±0.2961）2）3）8.939±0.9361）2）F值 413.244 350.815 77.669 481.958P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

尼莫地平属于第2代二氢吡啶类钙拮抗剂，具有脂溶性高，溶解度低，可以透过血-脑屏障、胎盘屏障等生理屏障[9]，已在临床广泛应用。1998年PILTZ[10]最早应用于正常眼压性青光眼（normal tension glaucoma,NTG）患者100例，通过对视野范围和视敏度及视力的观察，表明尼莫地平对NTG患者具有一定疗效。随后相似的研究进一步观察NTG的视网膜血液循环，表明NMD改善了NTG患者的视网膜血液循环[11]。大量的实验室也证实NMD具有保护神经节细胞，减少凋亡发生[12]。但临床的病例对照性研究中似乎并不是那么理想，因为口服给药需经过消化道吸收[7]，其口服生物利用度低。NMD对神经外科蛛网膜下腔出血早期给药可以减少脑血管痉挛的发生。HÄNGGI[8]通过制备尼莫地平-聚乙二醇（Nimodipine-poly（DL-lactide-co-glycolide）, PLGA）悬液，将极低剂量的NMD-PLGA注入小鼠和狗脑池内，分别检测29 d血清和脑脊液，取得持久的NMD浓度，也通过对SAH模型狗的治疗，降低了脑血管痉挛的发生。该缓释制剂减少静脉给药所引起的低血压等并发症的发生，也避免口服给药较低的生物利用度[8]。球周注射给药是眼科常用的并熟练掌握的给药途径，可以在眼内及局部达到有效、稳定的药物浓度，是口服给药难以达到的，也是静脉给药难以保障的。本实验显示，尼莫地平注射液球周注射，具有较好的RGCs保护作用。

细胞凋亡是凋亡基因控制下发生的，研究最广泛的Bcl-2是抑制凋亡基因，Bcl-2/Bax比值对细胞凋亡发生与否起决定性作用。本研究显示，Bcl-2在各组间有差异，NMD可以上调Bcl-2因子的表达，而保护RGCs的凋亡。Bax表达量在B、C两组呈高表达，而在D、E两组呈低表达，D、E两组与B、C两组比较有差异，证实NMD可以通过下调Bax表达抑制凋亡。在3种剂量之间，低剂量与中、高剂量比较有差异，而中高剂量比较无差异，该点与TUNEL检测结果与此相似，即D、E两组阳性细胞表达量P＞0.05，提示NMD在0.25 mg时便可发挥有效的保护作用，增加剂量并不能抑制凋亡的发生，可能的机制是NMD抑制钙离子内流的能力和细胞外钙离子内流的趋向力存在一定浓度差，当大于这一差值时钙离子内流难以抑制。本实验未给予更高浓度的剂量，该剂量相关性的上限并未显示。一但凋亡机制启动，凋亡将可能不可避免的发生。

实验显示，采用NMD注射液球旁注射对慢性青光眼兔RGCs具有保护作用，可能通过抑制钙离子内流上调Bcl-2表达，下调Bax表达。NMD球周注射还可以通过增加眶内段视神经周围的药物浓度，通过轴浆运输到达中脑上丘。

青光眼的神经保护是从视路性疾病的角度出发，目前研究认为CCBs在中枢神经系统无论是外伤性及退行性变是有积极意义的[12]。本实验NMD球周注射向临床治疗提供新的思路，局部高浓度的NMD是神经保护的重要条件，但多次注射仍会受到限制，未来缓释系统的研发将会降低注射的次数，这将会使NMD眼局部给药成为理想的给药途径。