N-乙酰半胱氨酸对丙酮醛诱导的人肾小管上皮细胞损伤的保护作用及机制研究*

罗婷，庄晓东，凡栋，顾海风，陈燕玲，康毅，吴秀香，王晓玲

（1.遵义医学院珠海校区 病理生理学教研室，广东 珠海 519041；2.中山大学附属第一医院 心血管内科，广东 广州 510080；3.中山大学肿瘤医院 妇科，广东 广州 510080）

丙酮醛作为葡萄糖代谢的副产物，是晚期糖基化终产物（advanced glycosylation end products, AGEs）的前体，可快速生成AGEs[1]。近年来，越来越多的研究发现，丙酮醛在糖尿病患者靶器官损伤中具有重要作用[2]。长期高血糖可导致丙酮醛生成增加，丙酮醛可通过修饰蛋白质、脂质及核糖核酸等引起细胞损伤。体外研究发现，肾系膜细胞、心肌细胞及内皮细胞等经丙酮醛处理后均发生明显损伤[3-5]。而笔者前期的研究也发现，丙酮醛可以引起人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）损伤[6]。肾小管上皮细胞损伤在糖尿病肾病发生、发展中具有重要作用。肾小管上皮细胞凋亡可使肾小管重吸收及排泌功能失调，促进肾小管萎缩及肾功能恶化。而目前，在临床上还缺乏针对糖尿病肾病的特效药，只能通过对症治疗，疗效欠佳。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cystein, NAC）是临床上治疗慢性呼吸系统感染时常用的一种祛痰剂。是一种作用非常广泛的氨基酸，研究报道其具有清除自由基、抗氧化应激、调节基因表达和信号转导系统以及抑制细胞凋亡等作用[3]。NAC能否减轻丙酮醛诱导的肾小管上皮细胞损伤，目前尚未见报道。本实验以HK-2细胞作为研究对象，探讨NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞损伤是否具有抑制作用，并初步探讨其可能的机制，为临床治疗糖尿病肾病提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 HK-2细胞来源及细胞培养 HK-2细胞由中山大学中山医学院高血压研究所王蔚东教授提供[7]。细胞接种于25 cm2无菌培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在37℃、5%二氧化碳CO2条件下培养，每隔1天进行1次细胞传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.1.2 药物与相关试剂 细胞培养用的DMEM/F12培养基、胰蛋白酶及胎牛血清购自Gibco公司，丙酮醛（购自上海源叶生物科技有限公司）（纯度≥95%），CCK-8细胞计数试剂盒（购自同仁化学研究所），Rh123及DAPI染色液（购自Sigma公司），Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、p-ERK1/2、GAPDH抗体（购自Cell Signaling Technology公司）。

1.2 实验仪器

蛋白电泳仪及细胞培养箱（Bio-Rad公司），荧光倒置显微镜（Olympus公司），酶联免疫检测仪（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 实验分组：对照组（只加正常培养基）、丙酮醛组（加入400 μmol/L丙酮醛处理24 h）、丙酮醛+不同浓度NAC组[400 μmol/L丙酮醛与不同浓度NAC（1、2、4及8 mmol/L）共孵育24 h]。

1.3.2 CCK-8法检测细胞生长活力 取处于对数生长期且生长状态良好的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，按2×108个/L的细胞密度接种在96孔板中。根据实验分组给予不同药物处理，每组设置5个平行复孔。细胞培养24 h后，弃上清液，每孔加入100 μl含10% CCK-8的无血清培养基，在37℃、5% CO2培养箱中孵育1.5 h，用酶标仪在波长450 nm处测定吸光度值（OD）。细胞活力（%）=（试验组OD值-空白孔OD值）/（对照组OD值-空白孔OD值）×100%。

1.3.3 DAPI染色观察HK-2细胞核形态变化 取处于对数生长期且生长状态良好的细胞，用胰蛋白酶消化后，按3×107个/L的细胞密度接种在6孔板中。按分组给予不同药物处理后，弃培养基，用4%多聚甲醛固定10 min，再用PBS漂洗3遍后，然后加入终浓度为1 μg/LDAPI染色液，37℃、5% CO2培养箱中避光孵育20 min，吸除DAPI染色液，再用PBS漂洗3遍，荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.4 细胞线粒体膜电位检测 取处于对数生长期且生长状态良好的细胞，胰蛋白酶消化后，按3×107个/L的细胞密度接种在6孔板中，每组设置3个平行复孔。根据分组给予相应药物处理24 h后，吸除培养基，用PBS清洗2遍，然后加入终浓度为100 μg/L罗丹明123的无血清培养基，37℃、5% CO2培养箱中孵育30 min，用PBS漂洗3遍，荧光显微镜下观察并随机选取10个不重复视野进行拍照。同时重复1次上述实验，在染色完成后，PBS漂洗3次，然后用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，离心，弃上清液，加入PBS吹打混匀，流式细胞仪上机检测细胞内线粒体膜电位变化。

1.3.5 Western blot测 定 HK-2细 胞 Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及p-ERK1/2蛋白表达水平 取处于对数生长期且生长状态良好的细胞，用胰蛋白酶消化后，按照4×106个/L的细胞密度接种在100 mm培养皿中，待细胞长至铺满皿底约85%时，根据实验分组加入相应药物处理24 h后，弃培养基，用预冷的PBS洗3遍，再加入150～250 μl含有PMSF的RIPA裂解液，在冰上裂解细胞20 min，然后用细胞刮把蛋白刮下来，收集到1.5 ml EP管中，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液。然后用BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Scientific Pierce）检测蛋白浓度。每个泳道上样量为60 μg蛋白。电泳：80 V恒压跑胶30 min；然后改为120 V恒压跑胶60 min；转膜：220 mA恒流转60 min，p-ERK1/2蛋白转90 min。PVDF膜用5%脱脂奶粉室温下封闭60 min，然后加入Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及p-ERK1/2抗体（抗体稀释倍数1∶1 000）孵育过夜，再用TBST洗3次，加入辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗（抗体稀释倍数1∶5 000），室温下孵育60 min，TBST洗3次，最后经Jena成像仪扫描或者暗室曝光显影后，Image J软件分析条带的光密度值。GAPDH为内参，以目的条带与内参的密度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间正态分布的计量资料比较用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞活力的影响

显微镜下示，正常HK-2细胞呈椭圆形或梭形，并呈铺路石样排列（见图1）。与对照组比较，加入400 μmol/L的丙酮醛后，HK-2细胞活力降低，约有对照组的40%（P＜0.01），而加入不同浓度的NAC处理后，HK-2细胞活力均有不同程度的升高，且随着NAC剂量的增加，细胞活力呈剂量依赖性升高（P＜0.01）（见表1）。

2.2 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞凋亡的影响

正常HK-2细胞经DAPI染色后细胞核呈现均匀的低密度蓝色荧光。对照组HK-2细胞胞核显示均匀的低密度蓝色荧光，经400 μmol/L丙酮醛处理后，部分细胞胞核出现局部高密度蓝色荧光，呈明显的凋亡特征，即呈现核分裂及核固缩。而使用不同浓度NAC处理后，具有凋亡形态的细胞核数量减少。见图2。

表1 不同浓度NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞活力的影响 （n=5，%，±s）

表1 不同浓度NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞活力的影响 （n=5，%，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与丙酮醛组比较，P＜0.05

细胞活力组别对照组 113.700±1.578 400 μmol/L 丙酮醛组 48.528±1.3661）400 μmol/L 丙酮醛 +1 mmol/L NAC 组 56.544±0.4872）400 μmol/L 丙酮醛 +2 mmol/L NAC 组 67.896±2.2602）400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 组 83.622±0.8112）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 组 87.759±0.7652）F值 308.770P值 0.000

图1 正常HK-2细胞形态 （×100）

2.3 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞线粒体膜电位的影响

对照组HK-2细胞绿色荧光强度较强，线粒体膜电位较高；而经400 μmol/L的丙酮醛处理后，绿色荧光强度减弱，线粒体膜电位降低；但加入NAC处理后，线粒体膜电位逐渐升高，以8 mmol/LNAC组最为明显。通过流式细胞仪检测也可得到相似的结果，1和2 mmol/L NAC处理组平均荧光强度与丙酮醛组比较差异无统计学意义。当NAC浓度增高至4 mmol/L时，平均荧光强度增高，与丙酮醛组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、4 和表2。

2.4 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

Western blot检测，与对照组比较，HK-2细胞经丙酮醛处理后，Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.01）。而经不同浓度NAC干预后，Bax/Bcl-2比值降低（P＜0.01）。见图5和表3。

2.5 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响

Western blot结果显示，对照组HK-2细胞Cleaved Caspase-3蛋白有基础量表达，丙酮醛作用24 h后，HK-2细胞Cleaved Caspase-3蛋白表达量较对照组增高（P＜0.01），而加入不同浓度NAC处理后，各组细胞Cleaved Caspase-3蛋白表达量降低（P＜0.05）。见图6和表4。

2.6 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞p-ERK1/2蛋白表达的影响

对照组HK-2细胞p-ERK1/2蛋白有基础量表达，经400μmol/L浓度的丙酮醛作用24 h后，p-ERK1/2蛋白表达水平升高（P＜0.05），而加入不同浓度NAC处理后，各组细胞p-ERK1/2蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。见图7和表5。

图2 各组细胞核形态学变化 （DAPI荧光染色×200）

图3 各组细胞线粒体膜电位 （荧光显微镜×200）

图4 流式细胞仪检测各组细胞线粒体膜电位

表2 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞线粒体膜电位的影响 （n=3，±s）

表2 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞线粒体膜电位的影响 （n=3，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与丙酮醛组比较，P＜0.05

组别 平均荧光强度对照组 2 079.983±62.476 400 μmol/L 丙酮醛组 1 462.207±173.1871）400 μmol/L丙酮醛+1 mmol/L NAC组 1 610.097±117.216 400 μmol/L丙酮醛+2 mmol/L NAC组 1 712.750±107.291 400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 组 1 887.243±78.8702）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 组 1 994.003±99.9522）F值 4.474P值 0.016

图5 各组细胞Bax、Bcl-2蛋白表达 （n=3，±s）

表3 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞Bax与Bcl-2蛋白比值的影响 （n=3，±s）

表3 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞Bax与Bcl-2蛋白比值的影响 （n=3，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与丙酮醛组比较，P＜0.05

组别 Bax灰度值/Bcl-2灰度值对照组 0.672±0.067 400 μmol/L 丙酮醛组 2.617±0.1311）400 μmol/L 丙酮醛 +1 mmol/L NAC 组 0.581±0.0602）400 μmol/L 丙酮醛 +2 mmol/L NAC 组 0.498±0.0752）400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 组 0.249±0.0142）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 组 0.315±0.0522）F值 141.132P值 0.000

图6 各组细胞Cleaved Caspase-3表达（n=3，±s）

表4 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞Cleaved Caspase-3 蛋白表达的影响 （n=3，±s）

表4 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞Cleaved Caspase-3 蛋白表达的影响 （n=3，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与丙酮醛组比较，P＜0.05

组别 Cleaved Caspase-3灰度值/GAPDH灰度值对照组 0.517±0.062 400 μmol/L 丙酮醛组 1.185±0.0281）400 μmol/L 丙酮醛 +1 mmol/L NAC 组 0.887±0.0292）400 μmol/L 丙酮醛 +2 mmol/L NAC 组 1.026±0.0812）400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 组 0.428±0.0342）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 组 0.625±0.0372）F值 37.439P值 0.000

图7 各组细胞p-ERK1/2蛋白的相对表达（n=3，±s）

表5 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞p-ERK1/2蛋白表达的影响 （n=3，±s）

表5 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞p-ERK1/2蛋白表达的影响 （n=3，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与丙酮醛组比较，P＜0.05

组别 p-ERK灰度值/GAPDH灰度值对照组 0.687±0.066 400 μmol/L 丙酮醛组 0.996±0.1091）400 μmol/L 丙酮醛 +1 mmol/L NAC 组 0.506±0.0882）400 μmol/L 丙酮醛 +2 mmol/L NAC 组 0.497±0.0982）400 μmol/L 丙酮醛 +4 mmol/L NAC 组 0.518±0.0642）400 μmol/L 丙酮醛 +8 mmol/L NAC 组 0.448±0.0602）F值 6.155P值 0.005

3 讨论

以往对糖尿病肾病的研究主要集中在肾小球损伤，但是近年来研究发现在糖尿病肾病中肾小管损伤可能要早于肾小球损伤，且其在糖尿病肾病的发生发展中具有重要作用[8]。研究报道，糖尿病大鼠在病程第1周即可观察到肾小管扩张及肾小管上皮细胞变性，且随着时间推移，肾小管受损的数目增加，损伤程度加重[9]。糖尿病引起的肾小管损伤主要表现为肾小管上皮细胞肥大、高转运及凋亡。肾小管上皮细胞凋亡可促进肾小管萎缩及肾功能恶化[10]。因此，通过控制肾小管损伤可能可以达到预防及治疗糖尿病肾病的目的。

本研究显示，HK-2细胞经丙酮醛作用24 h后，细胞存活率降低，部分细胞发生凋亡；而经NAC处理后细胞存活率升高，凋亡细胞减少，说明NAC具有对抗丙酮醛诱导的HK-2细胞损伤的作用。

细胞凋亡主要有两种途径：外源性信号通路和内源性信号通路。内源性信号通路是由线粒体介导的。线粒体不仅是产生能量的关键场所，也是控制细胞存活的关键细胞器。线粒体膜电位的崩塌，细胞色素C的释放会启动Caspase级联反应，执行凋亡程序[11]。在该过程中还有Bcl-2家族的参与。Bcl-2蛋白是内源性凋亡途径的重要调节蛋白，当其表达量较高占主导地位时，可与Bax蛋白形成二聚体，抑制Bax的活性，预防细胞色素C从线粒体释放，从而抑制Caspase的活性[12-13]。而当Bax过表达占主导地位时，可与自身形成Bax/Bax同源二聚体，诱导细胞发生凋亡。因此，Bax与Bcl-2两者间的比例决定细胞是否发生凋亡。当细胞发生凋亡时，Bax与Bcl-2两者的比值会增高[14]。Caspase-3作为凋亡的执行蛋白，其激活是凋亡级联反应中的关键环节，抑制Caspase-3的激活可以抑制细胞发生凋亡[15-16]。本实验结果显示，NAC可以抑制丙酮醛引起的HK-2细胞线粒体膜电位降低，并且降低Bax/Bcl-2的比值及Cleaved Caspase-3蛋白表达，说明NAC可能通过线粒体途径抑制细胞凋亡。

研究报道，NAC可以分别通过抑制p38 MAPK信号通路以及JNK信号通路抑制丙酮醛诱导的人腹膜间皮细胞以及H9C2心肌细胞凋亡[3，17]。说明NAC抗凋亡的作用与MAPK信号通路密切相关。而糖尿病引起肾小管损伤也与MAPK家族相关。研究发现，糖尿病大鼠病程第2周起，肾小管上皮细胞ERK蛋白表达水平增高[9]。本研究结果显示，HK-2细胞经丙酮醛处理后，p-ERK1/2蛋白表达增高，而加入NAC后，p-ERK1/2蛋白表达降低，提示NAC对抗丙酮醛诱导的细胞损伤作用可能与抑制ERK1/2信号通路有关，但其确切机制还有待进一步探讨。

综上所述，NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞损伤具有保护作用，其机制可能与其抗凋亡及抑制ERK1/2信号通路有关。