UPLC-PDA测定尼莫地平片中尼莫地平的含量

2022-10-17王海燕吕宝兴李玉琴

中国药剂学杂志(网络版) 2022年5期

周伟，高奇，王海燕，吕宝兴，李玉琴*

（1. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东泰安 271000；2. 泰安市食品药品检验检测研究院，山东泰安 271016）

尼莫地平（Nimodipine）作为二氢吡啶类 L 型 Ca2+通道阻滞剂，可抑制脑血管细胞 Ca2+跨膜内流，阻止平滑肌的收缩，有效改善血管痉挛问题[1-2]。由于尼莫地平的脂溶性较好，可穿过血脑屏障到达脑组织[3]，因此临床上主要用于蛛网膜下腔出血、脑血管痉挛、高血压、缺血性脑损伤等疾病的治疗[4-5]。近年来，尼莫地平还常与盐酸多奈哌齐、奥拉西坦、吡拉西坦等药物联用治疗血管性痴呆[6-8]，有一定的治疗效果。

高效液相色谱法（HPLC）是尼莫地平含量测定的常用方法[9-11]，2020 年版《中国药典》二部中尼莫地平片的质量标准也使用了 HPLC 测定其含量[12]，但 HPLC 分析时间长，有机溶剂使用量大。而基于 HPLC 的理论发展的超高效液相色谱法（UPLC）有着小颗粒固定相填料、极低的系统体积和高灵敏的检测器，具有分析速度快、溶剂用量小、灵敏度高等优势。因此，本研究开发了 UPLC-PDA 测定尼莫地平含量，并进行了方法学考察，为尼莫地平的含量测定提供了高效率、低成本的新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Acquity UPLC H-class 超高效液相色谱仪（包含四元溶剂管理器、FTN 样品管理器和PDA 检测器，美国 Waters 公司）；KQ3200 E 型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；SHIMUADZU AUW220D 电子天平（日本岛津公司）。

1.2 药品与试剂

尼莫地平对照品（纯度 98%，批号 C12229356，上海麦克林生化科技有限公司）；尼莫地平片（30 mg/片，批号 2010194，山东新华制药股份有限公司）；甲醇（赛默飞世尔科技中国有限公司）；乙腈（赛默飞世尔科技中国有限公司）；甲酸（上海麦克林生化科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 尼莫地平对照品储备液的配制

精密称取尼莫地平对照品 5 mg，置于 50 mL 棕色量瓶中，加入甲醇适量，超声溶解，待其冷却至室温，以甲醇定容至刻度，摇匀，即得 100 μg·mL-1的尼莫地平对照品储备液，于 4 ℃ 下保存备用。

2.1.2 供试品溶液的配制

精密称重 20 片尼莫地平片，其总重为 1.965 g，将其研成细粉。精密称取片粉适量（约含尼莫地平 10 mg），置于 50 mL 棕色量瓶中，加入甲醇适量，超声溶解，待其冷却至室温，以甲醇定容至刻度，摇匀，离心（3 000 r·min-1× 15 min）。精密量取 5 mL 上清液, 置于 50 mL 棕色量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。供试品溶液临用时配制，进样前使用 0.22 µm 膜过滤。

2.2 色谱条件

Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），0.1% 甲酸-乙腈（40∶60）为流动相，流速 0.25 mL·min-1，检测波长 235 nm，进样量 1 μL，室温下测定。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性

分别精密量取甲醇、10 μg·mL-1的尼莫地平对照品工作液、供试品溶液各 1 μL，照“2.2”色谱条件分析，记录色谱图（见图 1）。由图 1 可知，甲醇对尼莫地平的测定无干扰，表明该法专属性良好。

Fig. 1 UPLC chromatograms of methanol, nimodipine reference solution and test solution 图 1 甲醇、尼莫地平对照品工作液、供试品溶液的UPLC色谱图

2.3.2 线性关系

以 100 μg·mL-1尼莫地平储备液为母液，以甲醇为溶剂，制备浓度为 1、2、5、10、25、50、100 μg·mL-1的尼莫地平对照品线性工作液，照“2.2”色谱条件测定，记录尼莫地平峰面积。以尼莫地平浓度（X）对其峰面积（Y）的回归方程为 Y = 1.384 4 × 104X - 7.049 4 × 103（r = 0.999 9），尼莫地平在 1～100 μg·mL-1浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 检测限（LOD）与定量限（LOQ）

信噪比（S/N）≈ 3∶1 时对照品的浓度为 LOD；S/N ≈ 10∶1 时对照品的浓度为 LOQ。测得基线噪声的平均峰高约为 19，计算得 LOD 与 LOQ 理论峰高应约为 57 和 190，并进行验证。将 1 μg·mL-1的尼莫地平对照品溶液逐级稀释，照“2.2”色谱条件测定，记录其 S/N，结果见图 2。由图 2 可得，LOD 为 12 ng·mL-1，LOQ 为 40 ng·mL-1，计算结果与验证结果基本一致。

Fig. 2 UPLC chromatograms of LOD and LOQ of nimodipine reference solution 图 2 尼莫地平对照品溶液LOD 与 LOQ 的UPLC色谱图

2.3.4 精密度

分别制备 5、50、100 μg·mL-1的尼莫地平对照品工作液，照“2.2”色谱条件测定，每一浓度测定 6 次，计算尼莫地平峰面积的 RSD。低、中、高溶液尼莫地平峰面积 RSD 分别为 0.21%、0.16%、0.12%，方法日内精密度良好。将上述溶液连续进样 3 天，每一浓度测定 6 次，得尼莫地平峰面积的 RSD 分别为 0.13%、0.069%、0.059%，方法日间精密度良好。

2.3.5 重复性

精密称取 6 份尼莫地平片粉（约含尼莫地平 10 mg）适量，照“2.1.2”项下方法平行制备 6份供试品溶液。在“2.2”色谱条件下测定，测定尼莫地平峰面积的 RSD。测得尼莫地平峰面积的RSD 为 0.41%，表明该法具有良好的重复性。

2.3.6 稳定性

供试品溶液于制备后的 0、2、4、6、8、10、12、24 h 照“2.2”色谱条件测定，测得尼莫地平峰面积的 RSD 为 0.17%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.3.7 加样回收率

精密称取尼莫地平 25 mg，置于 25 mL 棕色量瓶中，照“2.1.1”项下方法制备 1 mg·mL-1的尼莫地平对照品溶液。精密称取已知含量（约含尼莫地平 2 mg）的片粉 9 份（见表 1），分别置于 9 个 50 mL 量瓶中，三份一组。按照片粉中尼莫地平含量的 80%、100%、120%，向其精密加入 1 mg·mL-1的尼莫地平对照品溶液适量，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。在“2.2”色谱条件下测定，记录尼莫地平峰面积，每份供试品溶液测定 3 次。将所得尼莫地平峰面积带入线性关系项下回归方程中，计算加样回收率（见表 1）。表 1 显示，低、中、高三个水平的平均回收率分别为 98.24%、99.17%、100.7%，RSD 分别为 2.0%、0.4%、1.4%，表明回收率良好，方法准确可行。

Table 1 The results of recovery rate of nimodipine in the test sample 表 1 供试品中尼莫地平的加样回收率结果

2.3.8 样品含量测定

取 3 份尼莫地平片粉（约含尼莫地平 10 mg），精密称定，照“2.1.2”项下方法平行制备 3 份供试品溶液。在“2.2”色谱条件下测定，记录尼莫地平峰面积，每份供试品溶液测定 3 次。将所得尼莫地平峰面积代入线性关系项下回归方程中，计算尼莫地平的含量（见表 2）。测得尼莫地平片中尼莫地平标示量的百分含量为 97.96%，RSD 为 0.44%，符合 2020 年版《中国药典》二部中尼莫地平片标准应为标示量的（90.0～110.0）% 的规定。

Table 2 The results of the determination of nimodipine content in nimodipine tablets 表 2 尼莫地平片中尼莫地平含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长

提取 10 μg·mL-1尼莫地平对照品工作液色谱图对应的光谱图，发现尼莫地平在波长 235 nm处有 1 个特征吸收峰。该波长下色谱图基线稳定，因此选择 235 nm 作为检测波长。

3.2 流动相

分别使用了甲醇-水（70∶30）和乙腈-水（70∶30）作为流动相，比较其色谱图。甲醇-水为流动相时峰型较宽，对称性较差，而使用乙腈-水时峰形窄，但存在拖尾现象，这是由于尼莫地平在甲醇中的溶解度低于乙腈所致。为了改善峰拖尾现象，比较了乙腈-水（70∶30）和乙腈-0.1%甲酸（70∶30）作为流动相的色谱图，结果显示乙腈-0.1% 甲酸为流动相时尼莫地平峰对称性良好，拖尾得到了改善。为进一步改善峰形，尝试不同比例的乙腈-0.1% 甲酸，结果乙腈-0.1% 甲酸比例为 60∶40 时峰形尖锐美观，对称性较好。因此最终确定流动相为乙腈-0.1% 甲酸（60∶40）。

3.3 流速

流动相为乙腈-0.1%甲酸（60∶40），检测波长 235 nm，精密量取 10 μg·mL-1尼莫地平对照品工作液 1 μL，分别在 0.1、0.2、0.25 mL·min-1流速下测定，记录尼莫地平出峰时间，分别为6.608、3.355、2.667 min。比较了在上述流速下的峰形，并综合考虑分析效率，最终确定流速为 0.25 mL·min-1。

3.4 本法的优点

2020 年版《中国药典》二部中尼莫地平片的含量测定所使用 HPLC 法流动相为甲醇-乙腈-水（35∶38∶27），而本法流动相为乙腈-0.1%甲酸（60∶40），流动相组成较简单。除此之外，本法使用的流速为 0.25 mL·min-1，有机溶剂的使用量少。使用本法每个样品的分析时间仅为 3 min，分析效率得到了提高。