针刺百会穴与皮质γ-氨基丁酸能神经元缺血后功能障碍的相关性研究*

王建勋,孙丕云,周金龙,张淑岩△

(1.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000;2.哈尔滨医科大学附属第四医院，黑龙江 哈尔滨 150000)

缺血引起的脑细胞死亡始于神经元兴奋性毒性[1-2]。引起神经元兴奋性毒性的机制包括谷氨酸转运体的功能障碍[3]以及谷氨酸依赖的细胞内Ca2+和自由基增加[4-5]。针对上述机制的治疗方法对缺血性卒中并没有显著疗效[6]。因此需要探索缺血性卒中的其他机制和治疗策略。

缺血后γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)能神经元功能障碍导致细胞的兴奋性和抑制性之间失去平衡，这可能是产生神经元兴奋性毒性的机制之一[7]。既往研究发现针刺百会和足三里等穴位能明显改善缺血性卒中患者的预后[8-9]。本研究旨在探讨针刺穴位改善脑卒中预后的机制是否与针灸保护大脑皮质GABA能神经元功能有关。通过皮质脑片的全细胞记录，笔者发现针灸可以改善GABA能神经元缺血后的动作电位编码能力下降和突触传递功能障碍。

1　材料和方法

1.1　药品及试剂

NaCl：sigma公司;KCl：sigma公司;NaH2PO4：sigma公司;CaCl2：sigma公司;MgSO4：sigma公司;dextrose：sigma公司;HEPES：sigma公司;KOH：sigma公司;EGTA：sigma公司;Mg2+-ATP：sigma公司;Tris-GTP：sigma公司;葡萄糖酸钾：sigma公司;95% O2和 5% CO2：合肥巨网气体有限公司;NaOH:sigma公司。

1.2　实验动物

选择FVB-Tg(Gad GFP)4570Swn/J转基因小鼠(Jackson Lab,Bar Harbor,ME 04609,USA)，该小鼠是将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因插入小鼠谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)基因下游，使GFP与GAD同时表达。该小鼠大脑皮层GABA能神经元在荧光显微镜蓝光(波长488nm)的激发下，在高倍镜镜下可观察到该种神经元发出绿色荧光，以此与其他神经元相鉴别，为皮层GABA能神经元的正确选择提供保障。

1.3　实验分组

本实验分为3组： 缺血组、缺血加针灸组及对照组。

1.3.1缺血组小鼠出生后第20天处死，取脑制备皮质脑片，并建立体外缺血模型，全血细胞记录观察动作电位变化情况。

1.3.2缺血加针灸组针灸部位选择百会穴，穴位位于颅顶正中，冠状缝和矢状缝的交汇处。小鼠出生后的第13天给予穴位电刺激，两人配合操作，一人抓取活体小鼠以固定，另一人以0.25 mm×25 mm毫针向百会穴平刺约3 mm，每日两次，10 min捻转1次，平补平泻，捻转1 min，每次针刺持续20 min，连续刺激7天。连续1周。随后处死小鼠，取脑制备皮质脑片,并建立体外缺血模型，全血细胞记录观察动作电位变化情况。

1.3.3对照组小鼠出生后第20天处死，取脑制备皮质脑片，全血细胞记录观察动作电位变化情况。

1.4　脑片和神经元

3组实验小鼠于第20天吸入异氟烷麻醉，闸刀断头，振动切片机于4℃充分氧和(95% O2和5% CO2)的低钙人工脑脊液(Artificial Cerebrospinal Fluid，ACSF)中切出皮质脑片。脑片厚度为400 μm。低钙ACSF成分(mM)：124 NaCl,3 KCl,1.2 NaH2PO4,26NaHCO3,0.5 CaCl2,4 MgSO4,10 dextrose,5 HEPES,pH 7.35。脑片于25℃氧和ACSF中孵育1～2 h，ACSF成分(mM)：124 NaCl,3 KCl,1.2 NaH2PO4,26NaHCO3,2.4 CaCl2,1.3 MgSO4,10 dextrose,5 HEPES,pH 7.35。氧和ACSF灌流全浸式记录浴槽，脑片移至其中并在31℃下进行全细胞记录[10]。化学试剂均购自Sigma。本实验得到黑龙江省哈尔滨市实验动物管理与使用委员会(IACUC)的批准。

选择位于感觉皮质II～III层的皮质GABA能神经元进行全细胞记录。GFP标记的GABA能神经元在荧光显微镜(Nikon，FNE600)488 nm波长激发下呈现绿色荧光。

1.5　全细胞记录

皮质GABA能神经全细胞记录采用AxoPatch-200B放大器。神经元动作电位的记录模式为电流钳，突触后电流的记录模式为电压钳。由pClamp 10软件 (Axon Instrument Inc.,Foster CA,USA)进行数据采集和分析。放大器的输出带宽为3 kHz。全细胞记录电极内液成分为(mM)：150 K-gluconate,5 NaCl,5 HEPES,0.4 EGTA,4 Mg-ATP,0.5 Tris-GTP,and 5 phosphocreatine (2M KOH调pH为7.35)。电极内液由滤器(0.1 μm)过滤后实验当日使用，渗透压为295～305 mOsmol。电极电阻为5～6 mΩ。

观察GABA能神经元的内在特性以及对兴奋性突触传递的反应，以评价GABA能神经元的功能。去极化电流刺激诱发出GABA能神经元的动作电位。依据实验目的设置刺激强度及持续时间。GABA能神经元的突触反应由兴奋性突触传递介导。

本研究的GABA能细胞内在特性包括动作电位的阈电位(Threshold Potentia，Vts)和绝对不应期(Absolute Refractory Period,ARP)。Vts是诱发动作电位时的电压,测量ARP时，向细胞内输入多个3 ms去极化电流刺激，后一个刺激紧接着前一个动作电位之后见图3。通过改变刺激间期，将ARP规定为1个完整动作电位后出现下个动作电位概率为50%的两动作电位之间的时程。此外，群集动作电位锋间距(Inter-spike intervals,ISI)表示动作电位的发放容量[11]。群集动作电位由200 ms去极化刺激诱发，刺激强度为引发每个细胞单个动作电位的阈刺激(10 ms)。

在皮质脑片GFP标记的GABA能神经元上记录自发兴奋性突触后电流(Spontaneous excitatory postsynaptic currents，sEPSCs)，用来反映GABA能神经元接收其他细胞突触传递的能力。sEPSC的幅度表示GABA能神经元对突触前传递的反应强度，事件间期(inter-event intervals)表示GABA能神经元的突触活性。

1.6　体外缺血模型

通过减慢灌流速度(从2 mL/min到0.2 mL/min，持续6 min)以模拟缺血性脑卒中的动脉阻塞和侧支循环。减慢灌流速度2 min后测量动作电位内在特性和兴奋性突触反应，静息膜电位明显下降之前恢复正常灌流速度[12]。

2　结果

2.1　针灸对缺血后皮质GABA能神经元动作电位编码损伤的保护作用

图1表示缺血组与缺血加针灸组GABA能细胞群集动作电位的变化。与对照组(见图1A)相比，缺血(见图1B)减弱动作电位编码。而与缺血组(见图1B)相比，针刺百会穴能改善缺血后动作电位损伤(见图1C)。1～2锋间到4～5锋间的ISI值，对照组分别为7.8±0.29、9.1±0.32、10.12±0.38以及(10.78±0.41)ms(见图1A,n=32)，缺血组分别为11.34±0.58、12.79±0.72、14.1±0.78以及(15±0.9)ms(图1B，n=15)，缺血加针灸组分别为8.25±0.5、10.1±0.63、11±0.67以及11.6±0.59(图1C，n=17)。对照组与缺血组、缺血组与缺血加针灸组，相应锋间的ISI值具有统计学差异(P<0.01)。针刺百会穴对缺血后皮质GABA能神经元动作电位编码的损伤具有保护作用。GABA能神经元的群集动作电位由去极化刺激(200 ms)诱发。

2.2　针灸拮抗缺血后阈电位的升高和不应期的延长

图2～3表示缺血和针刺百会穴对皮质GABA能神经元Vts和ARPs的影响。对照组、缺血组和缺血加针灸组阈电位的比较见图2。对照组阈电位为(22.1±0.79)mV(A，n=32)，缺血组为(27.1±0.9)mV(B，n=15)，缺血加针灸组为(23.1±0.78)mV(C,n=17)。统计分析表明，缺血组和对照组以及缺血组和缺血加针灸组之间比较，阈电位有统计学差异(P<0.01)。因此，缺血影响皮质GABA能神经元激发群集动作电位，针刺百会穴能拮抗缺血的作用。

对照组、缺血组和缺血加针灸组动作电位不应期的比较见图3。缺血能延长动作电位不应期，针灸能拮抗缺血的作用。对照组不应期的值为(4.13±0.07)ms(A,n=32)，缺血组为(4.82±0.15)ms(B，n=15)，缺血加针灸组为(4.18±0.198)ms(C,n=17)。统计分析表明，缺血组和对照组以及缺血组和缺血加针灸组之间比较，不应期有统计学差异(P<0.01)。因此，缺血致使皮质GABA能神经元动作电位不应期延长，针刺百会穴能拮抗缺血的作用。

图2　针灸拮抗皮质GABA能神经元缺血后阈电位的升高　　注:阈电位(ΔV)是阈值电压(Vts)和静息膜电位(Vr)之间的差值;A对照组、B缺血组、C缺血加针灸组阈电位;与缺血组比较,**P<0.01;对照组n=32,缺血组n=15，缺血加针灸组n=17

图3　针灸拮抗皮质GABA能神经元缺血后动作电位不应期的延长　　注:A对照组、B缺血组、C缺血加针灸组动作电位不应期;与缺血组比较,**P<0.01;对照组n=32,缺血组n=15,缺血加针灸组n=17

2.3　针灸对缺血后皮质GABA能神经元突触反应损伤的保护作用

缺血和针灸对兴奋性突触传递的影响见封三彩图4。缺血大幅降低sEPSC的幅度和频率(封三彩图4A左与中)，针刺百会穴能拮抗缺血的作用(封三彩图4A中与右)。封三彩图4B表示对照组(红色)、缺血组(蓝色)和缺血加针灸组(绿色)的累积概率与sEPSC幅值曲线，封三彩图4C表示累积概率与事件间期曲线。缺血组和对照组以及缺血组和缺血加针灸组之间比较，sEPSC的幅度和频率有统计学差异(P<0.01，n=10)。因此，针刺百会穴对皮质GABA能神经元兴奋性突触传递的缺血后损伤具有保护作用。

3　讨论

全细胞电流钳模式下，记录缺血加针灸组与对照组小鼠皮质GABA能神经元的群集动作电位。群集动作电位由去极化刺激诱发。动作电位锋间距(Inter-spike intervals,ISI)表示动作电位的发放容量[13]。

受电压门控钠通道调控的阈电位和不应期，控制着动作电位参数[14]。既往研究表明，针灸对动作电位编码缺血后损伤的保护作用可能与针灸减弱缺血对阈电位和不应期的影响有关[15]。为此笔者检测了不同条件下(实验方法)ARPs及Vts的改变。

笔者不仅研究了皮质GABA能神经元的动作电位编码，还观测了GABA能神经元的另一功能，即其对突触前皮质神经元突触输入的反应能力。在皮质脑片GFP标记的GABA能神经元上记录自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)。sEPSC的幅度表示GABA能神经元对突触前传递的反应强度，事件间期(inter-event intervals)表示GABA能神经元的突触活性。

本研究表明，缺血损伤皮质GABA能神经元的功能，包括损伤动作电位编码以及兴奋性突触传递，而针刺百会穴对皮质GABA能神经元功能的缺血后损伤具有保护作用。动作电位的阈电位和不应期由电压门控钠通道控制，缺血及针灸以此为靶点影响动作电位编码。针刺百会穴改善卒中预后[16-17]的机制包括：保护皮质GABA能神经元的功能，兴奋和抑制的再平衡以及减少缺血后神经元的兴奋性毒性损伤。

抗凝、溶栓和细胞保护药物并不能明显改善卒中患者的预后[18]。已经表明，针刺某些腧穴可以改善缺血性卒中的预后[19-20]，因此穴位刺激可能是治疗缺血性卒中的另一种方法。笔者发现改善皮质GABA能神经元缺血后的功能障碍以及降低神经兴奋性毒性，是针灸减轻缺血损伤的机制之一。

最近的研究表明，针灸减少缺血损伤的机制与针灸促使GABA能神经元标记物γ-氨基丁酸、钙结合蛋白和神经肽Y表达增加有关[21]。并且本研究发现针刺百会穴可增强GABA能神经元抵抗缺血性损伤的能力，因此挽救或增加GABA的功能是缺血性卒中的有效治疗方法，可防止缺血性卒中后中枢神经系统的细胞凋亡和坏死，促进神经元再生。

就针灸作用的分子靶点而言，针刺穴位下调caspase-3、核因子-κB和环氧合酶的表达[22]，同时上调内皮细胞生长因子[23]，从而降低了脑组织的缺血性损伤。因此，针灸通过多种信号传导途径，防止缺血性卒中后中枢神经系统的细胞凋亡和坏死，促进神经元再生。