低频电针足三里对酒疸证模型大鼠治疗作用的尿液代谢组学研究*

佟　欣，刘学凯，周　越，付　琳，王　洋，赵法政

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

酒疸是因酒伤所致的黄疸病，是中医证候的一种，始见于《金匮要略》记载,以身目俱黄、心中懊憹热痛、腹满不欲食、时时欲吐、面发赤斑、足胫满及小便黄等为主要症状[1]。现代医学认为酒疸与西医学的酒精依赖相关，是一种以强迫性饮酒的行为和心理为特点，并伴有体内代谢障碍的身心疾病。世界卫生组织报道，由于酒精滥用而引起的一系列社会问题已成为全球第三大公共卫生问题，并呈逐年上升的趋势。

关于酒疸的治疗临床多采取药物治疗的方法，长期使用导致肝、肾等多脏器的损伤，患者在承受巨大经济负担的同时，给身体带来严重的伤害。针灸疗法是在中医基础理论的指导下，将人的生理和心理作为有机的整体，具有身心同治的治疗优势[2-3]。在临床治疗的过程中，针灸疗法不但充分考虑生物因素对疾病的影响，更加注重各种心理因素对疾病转归的作用。针灸治疗通过辨明病人的身心特点，对病人进行个性化的治疗，方法更人性化，更有利于疾病的治疗和康复，是临床治疗身心疾病安全、有效的方法。

1　材料

1.1　药品与试剂

α-萘异硫氰酸酯(Sigma公司)；无水乙醇，分析纯(天津市永大化学试剂开发中心)。甲醇，色谱级(默克公司)；屈臣氏蒸馏水(屈臣氏公司)；甲酸，色谱级(天津市科密欧化学试剂有限公司)；亮氨酸脑啡肽(SIGMA公司)；异丙醇，分析级(天津博迪化工有限公司)；氢氧化钠(分析级,天津市化学制剂六厂)；TBIL试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，20170305)；TAB试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，20170404)；TG试剂盒(上海中医药大学，20170425) ；CHO试剂盒(上海中医药大学，20170202)。

1.2　动物

健康雄性Wistar大鼠，动物合格证号：SCXK(黑)2017004，体质量(200±20)g，实验前正常饮食、饮水饲养1周。

1.3　实验器材

液相色谱仪(Waters公司)；质谱仪(Waters公司)；色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm；KDC-160HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限中佳分公司)；电子分析天平Mettler-Toledo Instruments(其林贝尔仪器制造有限公司)；G-6805电针治疗仪(上海医疗器械厂)；0.30 mm×1.3 cm针灸针(上海医疗器械厂)。

2　方法

2.1　供试品溶液的制备

乙醇溶液的配置：配置6%(v/v)乙醇的水溶液；α-萘异硫氰酸酯(ANIT)供试液的配置：将4.8 gα-萘异硫氰酸酯(ANIT)样品，均匀混合于120 mL橄榄油中, 制备4%浓度的α-萘异硫氰酸酯(ANIT)供试液。

2.2　造模

实验动物分组后，分笼饲养，自由食水，同等条件下饲养3天。30只Wistar大鼠随机分为3组：空白组、模型组和针刺组。空白组：自由进食、饮水，连续28天。模型组：每天给予6%(v/v)乙醇的水溶液，并作为饮水的惟一来源。自由进食28天[4]。于第26天灌胃给予α-异硫氰酸萘酯(ANIT)7.5 mg/100 g，于第27天灌胃给予α-异硫氰酸萘酯(ANIT)2.5 mg/100 g[5-6]。

针刺组:于第29天将酒疸证模型大鼠固定，按照《实验针灸学》的方法[7]，选取G-6805电针治疗仪、0.30 mm×1.3 cm针灸针，通电针刺双侧足三里，频率2 Hz，深度0.4 cm，治疗时间40 min，电流刺激强度以大鼠大腿轻度抖动为度，急性电针1次，慢性6次。共治疗7天。

2.3　样品采集和制备

收集实验过程中每只大鼠每天的尿液，连续35天。每次取样后进行离心处理，离心温度设置在4℃，离心处理5 min后过滤膜备试。用1%戊巴比妥钠0.15 mL/100 g腹腔注射麻醉，肝门静脉取血后置肝素钠管中，4℃、3 000 rpm的条件下离心15 min，取上清液，血清按照相应试剂盒测定方法，分别测定TG、CHO、TBIL、TBA。

2.4　色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLCTMBEHC18column(50 mm×2.1 mm id,1.7 μm,WatersCorp,Milford,USA)；流速：0.40 ml·min-1；柱温：45℃；流动相A:0.1%甲酸水溶液，流动相B:0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1。二极管阵列检测器全波长扫描，紫外检测器流出液不经分流直接导入质谱系统检测。

表1　梯度洗脱程序

2.5　质谱条件

电喷雾离子源(ESI),采用正离子模式检测；脱溶剂气流量为600 L·h-1,脱溶剂气温度为300℃，雾化气流量为100 L·h-1，离子源温度为110℃，毛细管电压为3 200 V，锥孔电压为35 V，微通道板电压为2 300 V，碰撞能为3 V。每0.14 s采集1次谱图；准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽(Leucine-enkephalin，[M+H]+=556.277 1)溶液。质量扫描范围：m/z100-900。以Centriod模式进行数据采集。

2.6　分析数据

3　结果

3.1　各组大鼠相关生化指标的比较

模型组与空白组相比TG、CHO、TBIL、TBA含量明显升高，有显著差异(P<0.01)，造模因素对大鼠脂代谢、胆红素代谢和胆汁酸代谢产生了影响。结果表明乙醇、α-萘异硫氰酸酯(ANIT)两因素复合酒疸证大鼠模型造模成功。针刺组与模型组相比TG、CHO、TBIL、TBA含量明显下降，有显著差异(P<0.01)。结果表明，低频电针足三里对酒疸证大鼠模型有治疗作用。见表2。

表2　各组大鼠TG、CHO、TBIL、TBA指数的比较

注：与空白组比较,*P<0.01;与模型组比较,▲P<0.01

3.2　大鼠尿液代谢组学分析

3.2.1优化实验条件实验进样量以0.40 mL/min的流速，在优化的色谱和质谱条件下，分离效果良好,见图1。

图1　正离子模式下空白组大鼠尿液BPI轮廓图

3.2.2针刺组与模型组差异性代谢产物的确定疾病的病理变化对应着体内生物体代谢轮廓的改变，通过对比针刺组与模型组大鼠尿液中代谢成分的变化，找到能够标识代谢主要差异点的物质，从而为佐证治

疗的效果和治疗的机制提供客观的体内代谢依据。如图2所示尿液BPI轮廓发生了明显的变化，说明其低分子量代谢物组的质或量不同，到针刺的最后1天这种差异达到最大值，可从代谢组学的角度佐证低频电针足三里对酒疸证大鼠模型的治疗作用。

图2　针刺组与模型组实验最后1天尿液代谢产物正离子模式UPLC/TOF-MS BPI轮廓注:A模型组;B针刺组

采用代谢组学的方法，将对离散程度贡献最大的离子进行结构鉴定和代谢途径鉴定，并确定为差异性代谢产物。通过采用TOF/MS的方法测定标记物的精确质量，得到测定误差范围内的相应化合物的元素组成和相应化合物不饱和度；通过分子式或分子质量检索化合物数据库，得到可能的化合物结构，再结合MS/MS数据筛选出一种或几种化合物，最终通过与对照品对比色谱保留行为以及MS/MS数据确立了4个差异性尿液代谢产物。见表3。

表3　离子名称结构式表

4　讨论

代谢组学技术具备分辨率高、灵敏度高、检测指标动态等优点，能够将体内差异性代谢产物的变化通过数据的形式全景的展现出来，与中医学的整体观思想不谋而合。代谢组学技术在中医证候动物模型建立的应用弥补了现代药理学检测指标的静止和片面等不足[8-9]。通过研究发现，低频电针刺酒疸证模型大鼠足三里，对动物机体的糖代谢、肠道菌群代谢产生了影响。

低频电针足三里后产生了差异性代谢产物对甲酚葡萄糖苷酸和2-苯乙醇葡萄糖醛酸苷,这两种物质都是体内糖代谢的产物。人体的消化系统参与糖代谢的全过程，糖代谢的紊乱可以间接影响蛋白和脂肪的代谢与合成的过程，从而影响能量的供应。临床上酒疸证的患者会出现体内糖代谢的紊乱和能量供应障碍。低频电针足三里可能从调节人体糖代谢的角度，改善酒疸证患者的生理和心理状态[10]。

由肠道微生物代谢产生N-甲基-1-萘甲胺和氧化N-甲基-1-萘甲胺代谢产物，再经尿液排出。肠道微生物对胆碱的利用不足可能使体内的胆碱来源不足，从而引发PC的合成减少，直接导致极低密度脂蛋白(VLDL)的合成不足，而后者是三脂酰甘油(TG)运输到肝外的主要载体，从而使TG在肝内堆积，导致脂肪肝的发生。针刺足三里产生的肠道微生物代谢产物，降低了三脂酰甘油(TG)的含量，近而影响人体消化系统的功能。

足三里是胃经合穴，具有较强的调节机体功能的作用, 对中医酒疸证有良好的治疗作用。脾胃为后天之本,水谷生化之源,通过针灸足三里可以调理足阳明胃经功能而强健全身。本研究用代谢组学的方法确证低频电针足三里对酒疸证模型大鼠的治疗作用，并鉴定了4个差异性尿液成分，从而为针灸治疗酒疸的有效性提供实践的依据和理论的来源。