PI 3 K、TNF-α 和PTEN在侵袭性垂体腺瘤中的相关性研究

张建伟，白中红，杨红霞

解放军第九十一中心医院肿瘤内科，河南 焦作454003

垂体腺瘤是临床上常见的中枢神经系统良性肿瘤，其发生于垂体前叶细胞，在颅内肿瘤中，其发生率仅次于脑膜瘤和脑胶质瘤[1-2]。部分垂体腺瘤具有向周围组织浸润生长的特点，其侵袭性生长时会突破垂体基底膜，累及海绵窦、下丘脑等部位，对患者的鞍周结构进行破坏[3-4]，临床上称之为侵袭性垂体腺瘤。侵袭性垂体腺瘤的治疗效果较差，复发率较高，有效治疗侵袭性垂体腺瘤是神经外科治疗的一大难题，是临床上亟待解决的问题[5]。阐明垂体腺瘤侵袭性生长的生物学机制对侵袭性垂体腺瘤的治疗大有裨益。细胞因子与垂体腺瘤的侵袭性生长密切相关，本研究旨在探讨侵袭性垂体腺瘤组织中磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源（phosphates and tensin homologuedeleted on chromosometen，PTEN）基因的表达情况，并对三者的表达情况进行相关性分析，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2014年3月至2017年3月解放军第九十一中心医院收治的61例垂体腺瘤患者。61例垂体腺瘤患者中，男28例，女33例；年龄16～86岁，平均（39.8±44.7）岁。根据腺瘤侵袭情况将患者分为侵袭组（n=33）和非侵袭组（n=28）。肿瘤直径：＜1 cm的微腺瘤患者22例，1～4 cm的大腺瘤患者28例，＞4 cm的巨大腺瘤患者11例。61例垂体腺瘤患者中，有33例侵袭性垂体腺瘤患者行MRI检查可见海绵窦和下丘脑等邻近结构遭到破坏，术中可见邻近硬脑膜以及鞍底骨质受侵袭遭到破坏，肿瘤侵入鞍旁血管神经或突入蝶窦腔。纳入标准：所有肿瘤患者均经临床诊断及病理检查证实，均符合Knosp分级标准。排除标准：服用生长激素抑制剂等药物及接受过放疗和化疗的患者。

1.2 试剂和方法

TNF-α鼠抗人多克隆抗体以及PTEN兔抗人多克隆抗体均购自美国CST生物技术公司，PI3K兔抗人多克隆抗体购自美国Abcam公司。山羊抗兔IgG免疫二抗和山羊抗鼠IgG免疫二抗均购自美国Bioworld Technology生物公司。SP试剂盒购自北京诺博莱德科技有限公司，DAB显色剂购自北京索莱宝科技有限公司。取样后，使用0.5 ml的4%多聚甲醛（多聚甲醛使用0.01 mol/L的PBS配制，配制过程中加入氢氧化钠辅助溶解，最后使用盐酸将pH值调节至7.0～7.6）固定细胞，固定后使用浓度梯度的乙醇进行脱水，再浸入二甲苯以及石蜡溶液中，浸泡结束后进行包埋，包埋后使用石蜡切片机进行切片，切片厚度为5 μm，使用48℃的温水进行展片，捞片后在60℃恒温箱中连续烘烤3～5 h。经过二甲苯以及浓度梯度的乙醇进行脱蜡和水化，使用3%浓度的甲醇双氧水灭活组织内源性的过氧化物酶，PBS冲洗3次后使用柠檬酸抗原修复液进行热修复。山羊血清封闭后加入一抗（1∶50），4℃孵育过夜，次日使用PBS冲洗3次后孵育二抗（1∶1000），37℃下使用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液孵育20 min，PBS冲洗后DAB显色，苏木素复染细胞核，再进行封片。

1.3 诊断标准

根据MRI检测海绵窦是否被侵犯，依照Knosp分级标准进行分级[6-7]：肿瘤局限在鞍内及颈内动脉内侧壁连线内，海绵窦未受侵为0级；肿瘤位于颈内动脉连线之内为1级；肿瘤位于颈内动脉外侧壁连线内侧，静脉丛被浸润已消失为2级；肿瘤生长至颈内动脉外侧壁连线外侧，浸至海绵窦外，海绵窦内各静脉丛以及海绵窦外侧腔消失为3级；肿瘤包裹海绵窦内颈内动脉，静脉丛消失为4级。当肿瘤包绕颈内动脉2/3时，侵袭海绵窦即可确诊为侵袭性垂体瘤。0～2级属于非侵袭性，3～4级属于侵袭性。

1.4 免疫组织化学染色及评价标准

免疫组织化学染色结果的判断主要根据高倍镜视野下阳性细胞在不同组织中所占的比例以及阳性细胞染色强度。①阳性细胞所占比例评分标准：阳性细胞所占比例在0～10%者1分，11%～50%者2分，51%～80%者3分，＞80%者4分；②阳性细胞染色强度评分标准：不着色0分，浅棕黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。上述两项评分相乘后，0分为阴性（－），1～3分为弱阳性（+），4～8分为阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。以4分为界点，＜4分为阴性，≥4分为阳性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用非参数Spearman等级相关性分析法进行相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PI 3 K、TNF- α和PTEN阳性表达情况的比较

侵袭组患者PI3K和TNF-α的阳性表达率高于非侵袭组患者，PTEN的阳性表达率低于非侵袭组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 两组患者PI 3 K、TNF- α和PTEN阳性表达情况的比较[ n（%）]

2.2 侵袭性垂体腺瘤组织中PI 3 K、TNF- α和PTEN表达情况的相关性分析

侵袭性垂体腺瘤组织中，PTEN和PI3K、TNF-α的表达不一致比例分别为84.85%（28/33）和75.76%（25/33）。经Spearman等级相关性分析结果显示，PTEN与PI3K、TNF-α的表达均呈负相关（r=-0.495，P=0.031；r=-0.883，P=0.024），PI3K与TNF-α的表达呈正相关（r=0.641，P=0.000）。（表2）

表2 侵袭性垂体腺瘤组织中PI 3 K、TNF-α 与PTEN表达情况的相关性分析

2.3 免疫组织化学检测PI 3 K、TNF- α和PTEN的表达情况

免疫组织化学检测结果显示，PI3K在侵袭性垂体腺瘤组织中呈棕褐色，而在非侵袭性垂体腺瘤组织中呈棕黄色；TNF-α在侵袭性垂体腺瘤组织中呈棕褐色，而在非侵袭性垂体腺瘤组织中呈棕黄色；PTEN在侵袭性垂体腺瘤组织中呈棕黄色，而在非侵袭性垂体腺瘤组织中呈浅棕黄色。（图1）

图1 PI 3 K、TNF-α 、PTEN在侵袭组和非侵袭组中的表达情况（免疫组织化学染色，×400）

3 讨论

随着生物技术的发展，已发现很多细胞因子可以调控细胞周期，并与肿瘤细胞的发生、发展以及转移密切相关。有研究显示，细胞因子参与侵袭性垂体腺瘤的发生、发展，对患者的神经产生重要的影响，这为侵袭性垂体腺瘤的靶向治疗以及神经功能的改善提供了新的靶标[8]。

PI3K、TNF-α和PTEN在神经系统恶性肿瘤中表达异常，且三者相互作用。现有研究结果显示，PI3K参与多种恶性肿瘤的发生、发展，其表达含量的多少与神经系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关，对神经系统产生重要的影响[3]。PTEN作为一种抑癌基因，其具有脂质磷酸酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶的双重活性，在PI3K细胞信号转导通路中，PI3K被激活，激活后生成PIP3，进而促进TNF-α的激活，而PTEN基因编码生成的蛋白则可以特异地使PIP3脱磷酸，TNF-α的活性受到抑制，导致PI3K/TNF-α细胞信号转导通路被阻断，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，对神经细胞的增殖具有重要作用[9]。同时，PTEN可以引发细胞周期蛋白依赖性激酶的活性降低，使细胞阻滞于细胞周期的G1期，细胞增殖明显受到抑制。PTEN也可以通过FAK通路影响细胞功能，促进FAK脱磷酸，抑制整合素介导的细胞转移过程以及细胞侵袭和骨架蛋白的组装[9]。TNF-α具有与冈田酸相似的功能，但功效远远高于冈田酸，可以有效刺激成纤维细胞热休克蛋白27以及波形蛋白的磷酸化，进而诱导肿瘤的发生，其在作用过程中可以对一氧化氮合成酶产生作用，促进一氧化氮的合成，加速对DNA的损伤，从而发生基因突变，进而导致肿瘤发生[9-11]。垂体腺瘤一般为良性，可是当垂体腺瘤具备侵袭性时，瘤体逐渐变大，存在局部浸润情况，瘤体对周围组织进行浸润，对患者神经系统的功能产生影响，从而对患者的性功能也会产生一定的影响。手术治疗难以对侵袭性垂体腺瘤彻底切除，患者存在复发的可能，患者的预后也较差，使用科学的方法尽早发现垂体腺瘤是否具有侵袭性倾向，有利于帮助垂体腺瘤患者早期治疗和有效恢复[12]。本研究结果显示，侵袭组患者PI3K和TNF-α的阳性表达率高于非侵袭组患者，PTEN的阳性表达率低于非侵袭组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。侵袭组中PTEN与PI3K、TNF-α的表达均呈负相关，PI3K与TNF-α的表达呈正相关，表明PTEN与PI3K以及TNF-α是呈相互拮抗存在的。综上所述，PI3K、TNF-α和PTEN对侵袭性垂体腺瘤的早期诊断及治疗具有重要的参考价值，为治疗侵袭性垂体腺瘤提供了新的治疗靶标。

[1]李鹏,张庆九,马法,等.PI3K、AKT和PTEN在侵袭性垂体瘤中的表达和相关性研究[J].现代中西医结合杂志,2015,24(33):3665-3667;3670.

[2]Günther T,Culler M,Schulz S.Research resource:realtime analysis of somatostatin and dopamine receptor signaling in pituitary cells using a fluorescence-based membrane potential assay[J].Mol Endocrinol,2016,30(4):479-490.

[3]邓如明,孙春明,冯鸣,等.PI3K、AKT、PTEN在脑胶质瘤中的表达及其临床意义[J].中国神经肿瘤杂志,2010,8(2):88-94.

[4]Saeger W,Honegger J,Theodoropoulou M,et al.Clinical impact of the current who classification of pituitary adenomas[J].Endocr Pathol,2016,27(2):104-114.

[5]Ghazi AA,Rotondo F,Kovacs K,et al.Treatment of invasive silent somatotroph pituitary adenoma with temozolomide.Report of a case and review of the literature[J].Endocr Pathol,2015,26(2):135-139.

[6]Knosp E,Steiner E,Kitz K,et al.Pituitary adenomas with invasion of the cavernous sinus space:a magnetic resonance imaging classification compared with surgical findings[J].Neurosurgery,1993,33(4):610-617.

[7]潘源,韩冲,陈高明,等.ADAM10表达和垂体腺瘤海绵窦侵袭性的关系[J].中华神经外科疾病研究杂志,2013,12(2):138-141.

[8]杜立平.促甲状腺激素TSH受体基因突变同侵袭性垂体瘤的相关性研究[J].国际检验医学杂志,2013,34(8):921-922.

[9]Briceno V,Zaidi HA,Doucette JA,et al.Efficacy of transsphenoidal surgery in achieving biochemical cure of growth hormone-secreting pituitary adenomas among patients with cavernous sinus invasion:a systematic review and metaanalysis[J].Neurol Res,2017,39(5):387-398.

[10]田梦.伽玛刀治疗垂体瘤的护理经验与体会[J].中国医学创新,2012,9(16):70-71.

[11]何璐,郭亮,胡春洪,等.垂体腺瘤MRI Knosp分级与Ki-67、p53、MMP-9的相关性分析[J].中华神经外科疾病研究杂志,2016,15(5):410-413.

[12]岳文涛,王小敏,王玥.PI3K/Akt/mTOR信号转导途径与非小细胞肺癌的关系[J].中国肺癌杂志,2009,12(4):312-315.