微小RNA-451调控COX- 2等细胞因子对人肝癌细胞株增殖和侵袭能力的影响△

马松林，谢飞，叶龙，吕洋

荆门市第二人民医院普外科，湖北 荆门448000

高复发率是影响肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者治疗效果的主要因素之一。目前，有研究认为肿瘤微环镜是导致肿瘤复发的重要因素。研究表明，HCC肿瘤微环境中环加氧酶2（cyclo-oxygenase-2，COX-2）表达过量是炎性反应的罪魁祸首[1]。近年来，有研究表明，microRNA通过调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移从而影响HCC的复发、转移和预后。微小RNA-451（microRNA-451，miRNA-451）在多种肿瘤组织中的表达明显下调，肿瘤细胞的增殖和侵袭能力明显增强[2-4]。miRNA-451表达下调后，受其调控的巨噬细胞移动抑制因子（migration inhibition factor，MIF）表达增加，促进了肿瘤的发生和转移[5]。本研究拟以miRNA-451为靶点，探讨miRNA-451对肿瘤微环境细胞因子表达的作用，从而证明miRNA-451在抑制HCC微环境炎性递质表达中的调控作用，为防治HCC的复发提供新的实验室依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

正常肝细胞株L-02以及人肝细胞癌的HCCLM-3、MHCC-97H/L、Huh-7、SMMC-7721、HepG-2（恶性程度：HCCLM-3＞MHCC-97H＞MHCC-97L＞Huh-7＞SMMC-7721＞HepG-2）细胞株均由广西医科大学附属肿瘤医院捐赠。高糖DMEM培养液和胎牛血清均购自美国Gibco公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，SYBR®Premix和逆转录试剂盒均购自日本Takara公司，Matrigel胶购自美国BD公司，7300型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。miRNA-451反转录引物和RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-451高表达细胞株构建LV-premiRNA-451慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，转染细胞的具体步骤按照转染试剂盒操作说明进行。

1.2.2 荧光定量RT-PCR 采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测MIF、MAPK、ERK、COX-2、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）mRNA和miRNA-451的相对表达量：取对数生长期的HCC细胞株，采用Trizol法提取细胞中的总RNA，取适量的总RNA进行逆转录，获得的cDNA于-20℃保存。以cDNA为模板进行RTPCR。反应体系：每管总量为 20.0 μl，SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ10.0 μl，上下游引物各 0.8 μl，模板2.0 μl，灭菌蒸馏水6.4 μl；反应条件：94℃预变性1 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸5 min，共30个循环；72℃延伸10 min。以GAPDH为内参。应用2-△△Ct法计算相对表达量。实验重复3次。引物序列详见表1。

表1 荧光定量RT-PCR的引物序列

1.2.3 Transwell实验 采用Transwell小室检测细胞的侵袭和转移能力：取对数生长期的MHCC-97H细胞株作为空白对照组，转染LV-pre-miRNA-451的MHCC-97H细胞株作为LV-pre-miRNA-451组，应用不含血清的DMEM培养基制备成1×106/ml的细胞悬液，在Transwell上室中加入100 μl的细胞悬液（细胞侵袭实验需要制备人工基底膜，将Matrigel胶和无血清的DMEM培养基按照1∶3的比例混合），下室加入600 μl 10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃孵育24 h后用棉签擦去杯内细胞，在95%乙醇中固定30 min。下室细胞在吉姆萨中染色30 min。然后磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞2次，于显微镜下计数，随机选取5个视野，实验重复3次，取平均值。

1.2.4 平板克隆实验 空白对照组和LV-pre-miRNA-451组细胞按200/孔分别接种于6孔板，每组设置3个复孔。37℃孵箱中培养2周后进行吉姆萨染色，同时光学显微镜下观察，以≥50个细胞的细胞球作为1个克隆，并计算克隆形成率；克隆形成率＝（克隆形成数目/接种细胞总数目）×100%。实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测HCC细胞株中miRNA-451的相对表达量

HCC细胞株HCCLM-3中miRNA-451的相对表达量为（0.11±0.01），MHCC-97H中miRNA-451的相对表达量为（0.23±0.01），MHCC-97L中miRNA-451的相对表达量为（0.44±0.03），Huh-7中miRNA-451的相对表达量为（0.55±0.02），SMMC-7721中miRNA-451的相对表达量为（0.74±0.03），HepG2中miRNA-451的相对表达量为（0.70±0.01），与正常肝细胞株L-02细胞比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1）

图1 不同HCC细胞株miRNA-451的相对表达量

2.2 空白对照组和LV-pre-miRNA-451组miRNA-451的表达情况

转染72 h后，LV-pre-miRNA-451组miRNA-451的相对表达量较空白对照组上调了（12.09±0.15）倍（P＜0.05）。

2.3 MHCC-97 H细胞过表达miRNA-451后对各基因表达的影响

miRNA-451过表达后，MHCC-97H中MIFmRNA的相对表达量为（0.30±0.13），MAKPmRNA的相对表达量为（0.68±0.02），ERKmRNA的相对表达量为（0.48±0.02），COX-2mRNA的相对表达量为（0.56±0.01），TGF-βmRNA的相对表达量为（0.51±0.02），VEGFmRNA的相对表达量（0.42±0.02），PGE2mRNA的相对表达量为（0.76±0.03），与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图2）

图2 MHCC-97 H转染LV-pre-miRNA-451后相关基因的相对表达量

2.4 Transwell侵袭实验

培养24 h后，LV-pre-miRNA-451组侵袭至Transwell膜背面的细胞数量为（53±5）个，明显低于空白对照组的（79±4）个，差异有统计学意义（t=7.700，P＜0.01）。

2.5 Transwell迁移实验

空白对照组细胞迁移至Transwell膜背面的细胞数量为（34±4）个，LV-pre-miRNA-451组细胞迁移至Transwell膜背面的细胞数量为（17±4）个，空白对照组明显高于LV-pre-miRNA-451组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.6 平板克隆形成实验

HCC细胞株MHCC-97H过表达miRNA-451后的平板克隆形成率为（15.7±0.5）%，明显低于空白对照组细胞的（27.0±0.4）%，差异有统计学意义（t=31.705，P＜0.01）。

3 讨论

肿瘤微环境是指肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质等与肿瘤细胞共同构成的局部内环境，其在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程中发挥着至关重要的作用[6]。COX-2能够导致肿瘤微环境中TGF-β、VEGF、PGE2、白细胞介素-10（IL-10）以及IL-12等因子分泌增加，促使肿瘤复发[7-9]。因此，下调COX-2的表达对于减少肿瘤的复发具有重要意义。

有研究采用了microRNA芯片技术，对术后早期肝癌复发（2年内复发）患者的癌组织和晚期复发（2年后复发）患者的癌组织进行分析，同时与正常肝组织进行比较，发现晚期复发组中癌组织中miRNA-451表达较正常肝组织下调[10]。本研究发现，在HCC细胞株中miRNA-451的表达与肿瘤的侵袭及转移等恶性行为关系密切。miRNA-451表达下调后，受其调控的MIF表达水平升高，促进了肿瘤的发生和转移[5]。而在肿瘤微环境的相关研究中，有研究表明MIF通过活化MAPK/ERK信号通路，最终导致COX-2表达上调，使肿瘤微环境产生炎性反应，从而导致肿瘤复发或转移[11]。推测miRNA-451表达下调后，MIF表达水平增高，从而导致COX-2增多，肿瘤微环境产生炎性反应，导致HCC术后远期复发。

本研究通过HCC细胞株MHCC-97H过表达miRNA-451后发现，与肿瘤微环境相关的各基因MIF、MAKP、ERK、COX-2、TGF-β、VEGF、PGE2相对于空白对照组表达均出现下调，Transwell实验发现侵袭和迁移至Transwell膜背面的细胞数量相对于空白对照组均明显下降（P＜0.01）；MHCC-97H过表达miRNA-451后的平板克隆形成率也明显低于空白对照组细胞（P＜0.01）。因此，miRNA-451在HCC细胞株中的相对表达量下调，下调后可能通过活化MAPK/ERK信号通路，导致COX-2上调，并促进肿瘤微环境中炎性介质TGF-β、VEGF以及PGE2的生成和释放，从而进一步促进肿瘤的复发和转移。

miRNA-451是抑制HCC肿瘤微环境炎性反应的重要因子，通过阻断MIF/MAPK/ERK通路，最终减少COX-2的相对表达量，降低肿瘤微环境中的炎性反应，从而减少肿瘤复发，为防治HCC的复发提供一种新的实验室依据。

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