下调SRGN基因表达对乳腺癌细胞凋亡及JAK/STAT信号通路的影响

马剑锋，张艳彩，孙慧

郑州市第七人民医院1普外科，2实验室，郑州4500003河南省人民医院呼吸内科，郑州450000

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近些年该病在中国的发病率呈上升趋势，成为威胁女性健康的主要恶性肿瘤[1]。乳腺癌的发生发展是一个涉及多基因、多阶段的复杂过程，已有大量研究表明抑癌基因失活、癌基因激活影响乳腺癌的发生发展。因此，研究乳腺癌中抑癌基因及癌基因的表达情况，并研究其作用机制，对于乳腺癌的临床及分子靶向治疗具有重要意义。研究发现，小分子糖蛋白丝甘蛋白聚糖（serglycin，SRGN）的表达与癌细胞的侵袭和转移有关，SRGN可以促进乳腺癌细胞的侵袭及转移，抑制SRGN的表达可以降低乳腺癌细胞的侵袭及转移能力[2-3]，但关于SRGN对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制尚未清楚。因此，本研究通过RNA干扰技术沉默乳腺癌细胞中SRGN的表达，旨在研究其对乳腺癌细胞凋亡的影响，并研究其可能的分子机制，为乳腺癌的治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

正常乳腺上皮细胞MCF-10A及乳腺癌细胞MDA-MB-231、SMMC-7721、MCF7、HCC1569均购自美国模式菌种收集中心（ATCC）；胎牛血清、RPMI1640培养基、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、膜联蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙锭（PI）细胞凋亡试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase 3）、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2（phosphorylated Janus kinase 2，p-JAK2）、磷酸化的信号转导与转录因子3（phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3）抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将细胞置于水浴锅中，37℃解冻后，加入RPMI1640培养基（含有10%胎牛血清），置于体积分数为5%CO2、饱和湿度为95%的培养箱中培养。采用生长至对数期的细胞进行实验。

1.2.2 Western blot检测SRGN蛋白的表达水平取出培养瓶中融合度超过90%的细胞，采用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，于培养皿中每106个细胞加入裂解液100 μ（lRIPA∶PMSF=100∶1），冰上裂解30 min，离心，上清液即为总蛋白。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，每孔道加入总蛋白50 μg，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），电泳的初始电压为60 V，30 min后将电压调整至110 V，于溴酚蓝迁移至分离胶下缘1 cm时结束电泳，整个过程约2 h。电转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）后，采用5%的脱脂奶粉封闭过夜，置于水平摇床中，4℃孵育一抗过夜，SRGN及内参GAPDH抗体分别按照1∶500和1∶1000稀释，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1∶10000稀释），置于水平摇床中，室温下孵育1 h，洗膜，在化学发光凝胶成像仪上进行拍照分析。

1.2.3SRGNsiRNA转染MDA-MB-231细胞 将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，培养24 h，待细胞生长达70%～80%融合时进行转染，将SRGNsiRNA（siRNA-SRGN组）及阴性对照siRNA-Con（siRNA-Con组）经脂质体LipofectamineTM2000转染至MDA-MB-231细胞，仅加入脂质体的为空白对照组，培养4 h后换成完全培养基，收集转染48 h的细胞，采用Western blot检测各组细胞中SRGN蛋白的表达水平。

1.2.4 流式细胞术检测各组细胞的凋亡率 收集转染48 h的各组细胞，加入预冷的PBS洗涤细胞，胰酶消化细胞，调整细胞密度为5×105/ml，加入结合缓冲液 500 μl悬浮细胞，避光，于冰上加入 5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI稀释液，充分混匀后避光室温培养10 min，再加入冷却的400 μl结合缓冲液，1 h内采用流式细胞仪进行细胞计数，观察并比较各组细胞的凋亡率。实验重复3次。

1.2.5 凋亡蛋白及JAK/STAT信号通路蛋白表达水平的检测 凋亡蛋白cleaved caspase 3及JAK/STAT信号通路蛋白p-JAK2和p-STAT3表达水平的检测参照1.2.2方法。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对-数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SRGN蛋白在乳腺癌细胞及正常乳腺上皮细胞中的表达水平

Western blot检测结果显示，正常乳腺上皮细胞MCF-10A及乳腺癌细胞MDA-MB-231、SMMC-7721、MCF7、HCC1569中SRGN蛋白的表达水平分别为（0.096±0.011）、（0.526±0.057）、（0.312±0.038）、（0.488±0.052）、（0.301±0.029），5 种细胞中SRGN蛋白的表达水平比较，差异有统计学意义（F=53.043，P＜0.01）。乳腺癌细胞MDA-MB-231、SMMC-7721、MCF7、HCC1569中SRGN蛋白的表达水平均高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1）

图1 SRGN在乳腺癌细胞及正常乳腺上皮细胞中的表达

2.2 转染SRGN siRNA对MDA-MB-231细胞中SRGN蛋白表达水平的影响

SRGNsiRNA转染MDA-MB-231细胞48 h，Western blot检测结果显示，空白对照组、siRNACon组和siRNA-SRGN组中SRGN蛋白的表达水平分别为（0.337±0.042）、（0.316±0.040）、（0.087±0.010），3组比较，差异有统计学意义（F=49.963，P＜0.01）。siRNA-SRGN组的SRGN蛋白表达水平低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），siRNA-Con组和空白对照组的SRGN蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（图2）

图2 转染SRGN siRNA对MDA-MB-231细胞中SRGN蛋白表达水平的影响

2.3 转染SRGN siRNA对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

空白对照组、siRNA-Con组和siRNA-SRGN组的细胞凋亡率分别为（2.20±0.32）%、（2.28±0.38）%、（11.16±1.22）%，3组比较，差异有统计学意义（F=137.571，P＜0.01）。与空白对照组比较，siRNA-SRGN组的细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。（图3）

图3 转染SRGN siRNA对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

2.4 转染SRGN siRNA对凋亡蛋白及JAK/STAT信号通路蛋白表达水平的影响

空白对照组、siRNA-Con组和siRNA-SRGN组的cleaved caspase 3蛋白表达水平分别为（0.037±0.007）、（0.048±0.008）、（0.125±0.012），p-JAK2蛋白表达水平分别为（0.189±0.020）、（0.192±0.022）、（0.044±0.010），p-STAT3蛋白表达水平分别为（0.147±0.013）、（0.156±0.015）、（0.028±0.006），3组的cleaved caspase 3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（F1=80.510、F2=65.454、F3=106.835，P＜0.01）。与空白对照组比较，siRNA-SRGN组的cleaved caspase 3蛋白表达水平升高，p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图4）

3 讨论

图4 转染SRGN siRNA对凋亡蛋白及JAK/STAT信号通路蛋白表达水平的影响

近年来乳腺癌基因的研究成为热点，已有多个分子标志物应用于乳腺癌的临床诊断及治疗，但仍需发现更多的基因治疗靶点。SRGN属于小分子蛋白聚糖家族中的一员，可存在于细胞内，也可存在于细胞外，主要在内皮细胞、一些肿瘤细胞及胚胎干细胞中表达[4-6]。有研究发现，SRGN的表达与肿瘤的形成及转移密切相关，鼻咽癌细胞中SRGN的表达可促进癌细胞转移及上皮间质转化样改变[7]；SRGN在急性髓系白血病中的表达升高与肿瘤形成有关[8]；乳腺癌细胞中SRGN的表达升高，可提高肿瘤细胞的转移及侵袭能力[2-3]，然而SRGN对乳腺癌细胞凋亡的影响尚未清楚。

本研究采用Western blot检测正常乳腺上皮细胞和不同乳腺癌细胞中SRGN蛋白的表达水平，结果发现乳腺癌细胞中SRGN蛋白的表达水平高于正常乳腺上皮细胞，由于SRGN在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达水平最高，因此被选择作为本实验的研究对象。RNA干扰技术是近些年来发展起来的可使基因在转染后发生沉默的技术，具有特异性和高效性，在肿瘤治疗及基因功能研究等领域广泛应用[9-10]。本研究通过RNA干扰技术沉默MDA-MB-231细胞中SRGN的表达，并采用流式细胞术检测细胞凋亡率，结果发现，抑制SRGN的表达可使MDA-MB-231细胞的凋亡率升高。细胞凋亡受到Caspases家族影响，caspase 3是Caspases家族中的关键酶，位于级联反应的下游，生理条件下caspase 3以无活性的酶原形式在哺乳动物细胞及组织中存在，当有凋亡刺激时被活化，活化的caspase 3可导致细胞凋亡的不可逆[11-12]。目前caspase 3已作为包括乳腺癌细胞在内的多种细胞凋亡的检测[13-14]。本研究结果显示，SRGN表达受抑制后cleaved caspase 3的表达升高，提示SRGN促进乳腺癌细胞凋亡可能是通过上调cleaved caspase 3的表达实现。JAK/STAT信号通路参与细胞的增殖、凋亡、迁移、分化及免疫调节等生理过程，在多种肿瘤细胞中处于激活状态[15-16]。有研究表明，JAK/STAT信号通路对于乳腺癌细胞的增殖及凋亡具有重要作用，抑制该信号通路可抑制癌细胞的发生及发展[17]。本研究发现，抑制SRGN的表达可抑制JAK/STAT信号通路中p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达，提示SRGN可正向调控JAK/STAT信号，诱导乳腺癌细胞凋亡。

综上所述，SRGN在乳腺癌细胞中的表达升高，通过RNA干扰抑制其表达后可诱导癌细胞凋亡，并下调JAK/STAT信号通路蛋白的表达水平，其诱导细胞凋亡的方式是上调cleaved caspase 3的表达。本研究为深入探讨乳腺癌的发病机制奠定了一定的基础，提示SRGN可能成为乳腺癌的分子诊断及治疗靶点。但本研究内容有限，且未在体内试验中验证，因此尚需进一步研究。

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