氯替泼诺不同给药途径在比格犬体内药物动力学

唐虹，金鑫，闫晓娜

氯替泼诺是一种局部用新型的糖皮质激素类药物，是根据软药的原理研究设计出来的。软药是容易代谢失活的药物，在药物完成治疗作用后，按预先设定的代谢途径和可以控制的速率分解、失活并迅速排出体外，从而避免药物的蓄积毒性。氯替泼诺易被水解为无活性的有机酸，当用于眼睛后，迅速代谢为无活性的产物，降低了系统毒性，而抗炎作用比泼尼松龙更强。适用于治疗眼睛角膜、结膜以及眼前部的炎症，也可用于眼部手术后预防感染。文献报道氯替泼诺在临床上单独应用或与其他药物合用，治疗干眼症、过敏性结膜炎、急性前葡萄膜炎及眼部术后抗炎等，是既有效又安全的“原位”产生疗效的糖皮质激素[1-6]。本研究将氯替泼诺口服给药与滴眼给予含有氯替泼诺的滴眼剂后，比较不同给药途径血浆中氯替泼诺非活性代谢物PJ90与PJ91的药动学行为，以评价氯替泼诺给药后的安全性。

1 材料与方法

1.1 仪器 HP1100型高效液相色谱，检测器为紫外-可见光检测器(美国安捷伦公司)；数据采集：安捷伦工作站(美国安捷伦公司)；进样器型号7725i Rheodyne(美国Rheodyne公司)；TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；XW-80A型涡流混合仪(上海医科大学仪器厂)。

1.2 药品与试剂 试验制剂：氯替泼诺滴眼液，每剂每毫升含氯替泼诺5 mg，批号：060901-1；氯替泼诺胶囊，每粒含氯替泼诺50 mg，批号：060901-2；对照品：PJ90(批号：060901-3，纯度：97%)，PJ91(批号：060901-4，纯度：98.5%)。内标：分子式C18H14O10，纯度：99.0%。以上药物均由沈阳华泰药物研究有限公司提供。甲醇、乙腈均为色谱纯，36%乙酸为分析纯。

1.3 动物 健康成年比格犬共6只，3雌3雄，体质量为(10.3±0.5)kg，购自大连医科大学，许可证号：SCXK(辽)2002-0002。

1.4 样品采集 6只比格犬，试验前12 h禁食，给药后可以自由饮水，仍需禁食4 h。滴眼给药时每只眼滴入1滴(50 μL)，滴眼给药时按压内眼角2 min，防止药物进入鼻泪管。口服给药时每只犬给药1粒(50 mg)。

采样时间点如下：给药前，给药后15、30、45、60、90 min，2、3、4、6、8、12、24 h由后肢静脉采血1 mL；全血样品采集后即刻移入肝素化玻璃离心管内，以3 000 r/min离心10 min，将离心后的上层血浆移入另一干净血浆样品管内，-70 ℃冷冻保存待测。

1.5 试验条件 反相高效液相色谱柱：Diamonsil C18，150 mm×4.6 mm I.D.，5 μm，北京迪马公司；保护柱型号：DL-II YWG-C18，10 mm×4.0 mm，天津市色谱科学技术公司；流动相为乙腈∶甲醇∶水∶36%乙酸(体积比为50∶6∶56∶0.5)，流速为1.3 mL/min，色谱柱温度：25 ℃，紫外检测波长：245 nm。

1.6 血浆样品预处理 精密移取血浆样品200 μL，依次精密移取甲醇10 μL，内标溶液C18H14O10甲醇10 μL，内标浓度为15 mg/L。将溶液涡流混匀后，精密移取乙腈500 μL，涡流混合1 min，以3 000 r/min离心10 min。将离心后的样品上清液移入另一试管中，移取后的上清液在室温下，用氮气吹干，流动相100 μL复溶，取20 μL进样分析。

1.7 专属性 精密移取200 μL空白比格犬血浆，依上述血浆样品预处理操作，不加入内标，所得样品20 μL进行HPLC-UV分析，获得色谱图1a(见封三)；空白血浆分别加入浓度为1.5 mg/L的PJ90、1.0 mg/L的PJ91标准溶液，按上述血浆样品预处理操作，获得色谱图1b(见封三)。PJ90、PJ91和内标的保留时间分别为5.2、7.0、10.2 min。1只比格犬口服给予氯替泼诺0.75 h后的血浆样品，依上述血浆样品预处理操作，获得色谱图1c(见封三)。由所得色谱图可见，比格犬空白血浆中的内源性物质不干扰测定结果，在PJ90、PJ91和内标的出峰位置均无内源性物质的干扰峰出现。

1.8 定量限 根据相关规定[7]，定量下限要求能测定3～5个消除半衰期时未知样品中的药物浓度，或者能够检测出峰浓度1/10～1/20的药物浓度。本项试验中的血浆最低定量浓度分别为0.027 mg/L和0.018 mg/L，信噪比均>10，依据上述血浆样品预处理操作，平行制备3样本，制备三批定量下限样品，PJ90和PJ91定量下限批内精密度RSD分别为：10.4%和9.8%；PJ90和PJ91定量下限批间精密度RSD分别为：12.9%和15.2%；PJ90和PJ91准确度为：94.2%和95.3%。符合试验要求及相关规定。

1.9 血浆标准曲线制备 精密移取200 μL空白比格犬血浆，准确加入PJ90和PJ91的标准系列溶液10 μL，分别制备相当于PJ90血浆浓度0.027，0.067 5，0.135，0.45，1.5，3.0 mg/L和PJ91血浆浓度0.018，0.045，0.09，0.3，1.0，2.0 mg/L的血浆样品，依据上述血浆样品预处理操作，每一浓度平行制备3样本，准确进样20 μL。横坐标为血药浓度，纵坐标分别为PJ90或PJ91与内标的峰面积比值，采用加权最小二乘法进行回归运算，权重w=1/x2。所得PJ90直线回归方程为：y=5.219×10-1x-4.423×10-3，r=0.997 8；所得PJ91直线回归方程为：y=3.29×10-1x+6.172×10-3，r=0.999 1。结果表明，PJ90血药浓度在(0.027～3.0)mg/L内为线性关系良好，定量下限为0.027 mg/L；PJ91血药浓度在(0.018～2.0)mg/L内为线性关系良好，定量下限为0.018 mg/L。

1.10 精密度和回收率 (1)血浆精密度：精密移取200 μL空白比格犬血浆，依照上述血浆样品预处理操作，准确制备低、中、高三个浓度的质量控制样品，每一个浓度的血浆样品平行制备6样本，相当于PJ90血药浓度分别为：0.067 5，0.45，2.4 mg/L，相当于PJ91血药浓度分别为：0.045，0.30，1.6 mg/L。根据以上浓度连续制备三批质量控制样品，按照当批样品随行的标准曲线，计算出质量控制样品的测得浓度。采用同一批质量控制样品的测得浓度，计算本法的批内精密度RSD，PJ90为：2.8%、7.2%、7.0%，PJ91为：5.1%、5.8%、7.8%；根据连续三批的质量控制样品结果，计算本法的批间精密度RSD，PJ90为：6.1%、9.5%、8.5%，PJ91为：4.5%、7.4%、14.7%。

(2)血浆回收率：用空白血浆配制,分别配置低、中、高三个浓度样本，相当于PJ90血药浓度分别为：0.067 5、0.45、2.4 mg/L，相当于PJ91血药浓度分别为：0.045、0.30、1.6 mg/L。按上述血浆样品预处理后进样。将空白比格犬血浆样品按上述血浆样品预处理，不加入PJ90、PJ91及内标，移取上清溶液后，再分别加入PJ90和PJ91三个浓度等量的样品及内标溶液，以此为标准与同等浓度质量控制样品比较，计算两组峰面积比值，获得PJ90和PJ91提取回收率。PJ90三个浓度的血浆样品提取回收率分别为：98.8%、97.0%、99.1%，PJ91三个浓度的血浆样品提取回收率分别为：95.4%、98.6%、99.3%。

1.11 稳定性 本试验分别考察了PJ90和PJ91用高、中、低已知浓度的血浆质控样品经三次冷冻-解冻循环后的稳定性，样本在-70 ℃冷冻保存稳定，血浆样品经反复3次冻融循环后稳定，提取后的血浆样品在室温放置24 h后稳定，血浆样品融化后放置于室温2 h后再提取、进样，该样品稳定，样本在-70 ℃保存长期放置1个月稳定。结果表明，在上述条件下，PJ90和PJ91保持稳定(RE值在±15 %内)。

2 结果

2.1 平均血药浓度-时间曲线 6只比格犬分别经不同途径给药后，滴眼给药血浆中未测到药物浓度，口服给药后，不同时刻PJ90和PJ91平均血药浓度-时间曲线见图2。

图2 单次口服给药后PJ90和PJ91的平均血药浓度-时间曲线

2.2 药物动力学参数 氯替泼诺口服给药后，对其非活性代谢物PJ90和PJ91进行了药动学参数的进算，计算软件为DAS 2.0，结果见表1。

3 讨论

本研究检测方法参考文献[8-9]并加以改进。本实验模拟临床给药方式，考察糖皮质激素类药物氯替泼诺不同给药途径在比格犬体内的药物动力学行为，为临床用药安全提供参考。

表1 单次口服给药后PJ90和PJ91的主要药动力学参数

文献报道研究氯替泼诺犬体内的药动学行为时，犬口服给予氯替泼诺5 mg/kg后，只测到了代谢物，浓度约为0～200 μg/L，而未测到原形药物[9]。本实验室已完成的氯替泼诺家兔眼内药物动力学试验[10]亦证实无法测得原形药物，故本次实验通过检测代谢物PJ90和PJ91的血药浓度来考察给药后的安全性。犬给药剂量定为5 mg/kg，由于所购比格犬体质量相当，均为10 kg左右，故将50 mg氯替泼诺填胶囊后，每犬给药1粒(约相当于给药5 mg/kg)，并保证给药时胶囊完整。氯替泼诺为原位生效药物，给药后迅速代谢为无活性的代谢物，本实验对氯替泼诺比格犬口服给药后的代谢物PJ90和PJ91的浓度进行了测定，并计算了此两种代谢物的药动学参数，可作为参考。

滴眼给药时，考虑到滴眼液可能会通过鼻泪管进入口腔，不排除通过鼻黏膜吸收入血及通过口腔口服后吸收的情况，故在滴眼给药时按压内眼角2 min，尽量避免药物进入鼻泪管。

通过6只成年健康比格犬不同给药途径的药物动力学试验考察，氯替泼诺即使全身给药(口服)后，比格犬体内的代谢物PJ90和PJ91血药浓度依然很低，约为0～400 μg/L，可保证氯替泼诺临床用药的安全性。通过本试验可证实，氯替泼诺虽然是糖皮质激素类药物，但由于其原位生效的作用机制，即使在临床上儿童给药也是可以保证其安全性的。

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