高效液相色谱法测定猪肉中氨基比林、安替比林和安乃近代谢物残留量的研究

李 丹，王鹤佳，张玉洁，沈 昕，李 倩

(中国兽医药品监察所国家兽药残留基准实验室，北京 100081)

氨基比林(Aminopyrine)、安替比林(Antipyrine)和安乃近(Dipyrone，or Metamizole Sodium)为临床常用的解热镇痛药，属于吡唑酮类解热镇痛药[1]。其中，氨基比林是在安替比林的分子中引入二甲氨基得到，安乃近是在氨基比林的结构中引入水溶性的亚甲基磺酸钠得到。安乃近在体内可迅速水解成活性产物4-甲氨基安替比林(MAA)，特别是经首过作用后，几乎全部转变成MAA，再进入体循环，其药理作用主要由MAA产生[2]。这类药物的不良反应主要包括粒细胞减少、再生障碍性贫血、严重的过敏反应和休克虚脱等[3-4]。在兽医领域，这些药物主要作为一些严重疾病的辅助对症药物。由于其解热镇痛疗效确切，价廉易得，经常被长期过量使用，且由于不严格遵守休药期等原因，容易在动物体内产生蓄积残留，进而危害人类的生命健康。为加强兽药残留监控，保证动物性食品卫生安全，农业部于2002年发布第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定安乃近的残留标示物为4-甲氨基安替比林(MAA)，在猪的肌肉组织中的最高残留限量(MRL)为200 μg/kg[5]，欧洲药品管理局规定食源动物猪的肌肉中安乃近的最高残留限量为100 μg/kg[6](以MAA为残留标示物计算)。

由于氨基比林、安替比林和安乃近均为兽医临床最广泛使用的三种解热镇痛药，且结构极为类似。目前，国内外关于测定羊肉、牛肉、猪肉中安乃近代谢物的LC-MS/MS法、HPLC法等已有报道[7-9]，但采用高效液相色谱法同时测定猪肉中氨基比林、安替比林、安乃近残留的检测方法尚未见报道。本研究旨在建立一种操作步骤简单，并可满足同时检测猪肉中氨基比林、安替比林、安乃近残留的检测方法，从而使方法的普适性更好。

1 材料与方法

1.1 标准品、主要试剂及其配制 安替比林对照品：中国兽医药品监察所，含量≥99.9%；氨基比林对照品：中国食品药品检定研究院，含量≥99.9%；4-甲氨基安替比林对照品：中国食品药品检定研究院，含量≥96.6%。乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，美国Fisher公司；无水硫酸钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；氨水、甲酸，北京化工厂。水：美国Millipore超纯水仪制备，符合GB/T 6682-1992规定的一级水。

氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林混合标准储备液(1 mg/mL)：分别称取氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林对照品约10 mg，精密称定，于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为1 mg/mL的标准储备液。-20 ℃保存。

氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林混合标准工作液(10 μg/mL)：准确量取适量标准储备液，用甲醇溶解并稀释成浓度为10 μg/mL的标准工作液。-20 ℃保存。

1.2 主要仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外检测器)，美国安捷伦公司；AE 240型分析天平； Biofuge Stratos高速冷冻离心机，德国贺利氏公司；IKEA涡动混合仪；IKA-WERKE振荡器；MCX固相萃取柱：60mg/3mL。

1.3 方法

1.3.1 样品的提取 称取(5±0.05)g试料，置50 mL离心管中，乙腈8 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min，8000 r/min离心5 min，上清液转入50 mL离心管中，残渣再用乙腈8 mL，提取一遍，合并两次提取液，加无水硫酸钠4 g，10000 r/min离心5 min，上清液再转入50 mL离心管中，于40 ℃水浴下氮气吹至近干。加2%甲酸水溶液5 mL溶解，备用。

1.3.2 样品的净化 MCX柱用甲醇3 mL、2%甲酸水3 mL预洗。取备用液过柱，用2%甲酸水、甲醇各3 mL淋洗，挤干，5%氨化甲醇5 mL洗脱， 于40 ℃水浴下氮气吹干。加流动相1.0 mL，混匀，过滤膜，供高效液相色谱法测定。

1.3.3 色谱操作条件及参数 色谱柱: Phenomenex Luna C18 250 mm×4.6 mm (i.d)，粒径5 μm，或相当者；流动相为乙腈-水(20+80,V/V)；流速1.0 mL/min；检测波长265 nm；柱温30 ℃，进样量20 μL。

1.3.4 标准曲线的制备 准确量取适量氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林标准工作液，用流动相稀释成浓度分别为50、100、200、500、1000、2000 ng/mL的系列混合标准溶液，将此系列混合标准溶液，依次从低浓度到高浓度按液相色谱条件进行分析，每一浓度进样三次，按其所得三次峰面积的平均值与对应的对照溶液的质量浓度做标准曲线，并计算回归方程及相关系数。

1.3.5 回收率及精密度的测定 采用标准添加法，称取匀浆后的组织样品，置于50 mL离心管中，添加适宜浓度的氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的混合标准工作液，使猪肉中的药物浓度分别为20、100、400 μg/kg。每种浓度5个样品，重复3批次，按照1.3.1项和1.3.2项的方法处理后，供HPLC测定，外标法定量，计算回收率和批内、批间变异系数。

1.3.6 检测限和定量限的测定 对氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林标准工作液，进行HPLC分析，并逐渐降低氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的浓度，以溶液检测时的信噪比(S/N)分别大于等于3和10作为药物的检测限和定量限，并计算定量限浓度点的回收率及批内、批间相对标准偏差，验证其可靠性[10]。

2 结果与分析

2.1 色谱分离 在优化的色谱条件下，测得猪肉中氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林色谱峰峰形好，峰间隔时间较长，且均达到基线分离。空白组织样品在上述时间无干扰峰出现(图1)。

2.2 标准曲线 分别以氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的色谱峰面积与其对应的对照溶液的质量浓度做图，得到氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的标准曲线。氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在20～400 μg/kg的质量浓度范围内，色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系。线性回归方程、相关系数见表1。

A. 氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林500 μg·L-1对照溶液色谱图(1. Antipyrine ,2. 4-methylaminoantipyrine ,3.Aminopyrine)A. Chromatogram of Aminopyrine , Antipyrine and 4-methylaminoantipyrine 500 μg·L-1reference solution

B.猪肉组织空白色谱图B. Chromatogram in blank pig muscle

C. 猪肉组织中添加100 μg/kg氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林药物色谱图C. Chromatogram of Aminopyrine , Antipyrine and 4-methylaminoantipyrine 100 μg·kg-1 added in pig muscles(1. Antipyrine ,2. 4-methylaminoantipyrine ,3.Aminopyrine)图1 猪肉中氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的高效液相色谱图Fig 1 HPLC Chromatogram of Aminopyrine , Antipyrine and 4-methylaminoantipyrine in pig muscles

药物Drug 线性范围/(μg·L-1)Linear range回归方程Standard curve equation相关系数rCorrelation coefficient氨基比林50～2000 y=0.0465x-1.17360.9998安替比林50～2000 y=0.0567x-1.24240.99984-甲氨基安替比林50～2000 y=0.0437x-0.92280.9996

2.3 样品的回收率及精密度 由表2可以看出，猪肉组织中添加浓度水平分别为20、100、400 μg/kg时，氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的平均回收率分别在71.1%～85.1%、71.8%～78.9%、70.7%～83.6%范围内，批内、批间的RSD分别低于10.6%、10.9%。结果表明该方法可靠，重复性高。

表2 猪肉中添加氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的回收率测定结果(n=5)Tab 2 Recovery rate and precision of the drugs added in pig muscles

2.4 灵敏度 应用本试验建立的检测方法，测得猪肌肉组织中氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的检测限、定量限分别为6 μg/kg(S/N≥3)、20 μg/kg(S/N≥10)。由表2可见，添加浓度为20 μg/kg时，氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在猪肌肉组织中的平均回收率均大于71.1%，批内、批间的RSD分别低于10.6%、10.9%。表明该方法在定量限水平的可靠性好，且灵敏度高，完全满足氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在猪肌肉组织中残留检测的需要。

3 讨论与小结

3.1 仪器条件的优化 色谱条件的优化过程中，对流动相的种类及比例进行了考察，采用乙腈-水较甲醇-水的分析时间短，峰形好。调整流动相比例，发现乙腈-水比例为20∶80时，分析时间控制在20 min内，且三种目标化合物均达到完全分离。因此，流动相确定为乙腈-水(20∶80，V/V)。

3.2 提取溶剂的选择 在研究过程中，对样品的提取溶剂进行了实验摸索。采用乙腈、甲醇、硫酸钠+亚硫酸钠溶液分别进行提取实验，结果发现三种药物经乙腈提取，效果非常理想，对不同浓度的添加实验其回收率均高于70%，达到了残留检测的要求，因此，确立乙腈作为提取液。

3.3 样品提取与净化方法的优化 参考文献的方法对猪肌肉组织中的氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林进行了提取实验，但效果不理想，干扰杂质太多，达不到基本分离的要求，因此，样品经乙腈提取后，加入了无水硫酸钠进行盐析去杂质，并对无水硫酸钠加入的先后进行了对比实验，实验结果发现，无水硫酸钠与乙腈一起加入进行提取，样品溶液中杂质干扰依然很大，分离效果不太理想，但样品经乙腈提取完成后再加入无水硫酸钠进行净化，测定结果显示三种药物的回收率高，且均达到良好分离。实验过程中采用液-固提取的方法，对MAX、MCX、PCX、C18等不同类型的固相萃取柱进行摸索，结果表明三种药物经MCX柱净化后回收率最高。因此，本实验采用加入无水硫酸钠和MCX柱对样品进行净化。在进一步摸索洗脱条件时，比较了2%、5%、10%氨化甲醇的洗脱效果，结果表明5%氨化甲醇的洗脱能力最强，效果最好。因此，确立5%氨化甲醇作为洗脱溶液。

3.4 回收率及灵敏度 试验中氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的添加浓度范围为20～400 μg/kg时，回收率在70.7%～85.1%范围内，批内和批间RSD分别低于10.6%、10.9%，符合农业部对兽药残留试验规范中的要求[11]。通过添加定量限浓度点对其可靠性进行验证，结果发现氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在猪肉中的回收率均大于71.1%，批内、批间的RSD分别低于10.6%、10.9%。该方法在定量限水平的可靠性好，且灵敏度高，完全满足氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在猪肉中残留检测的需要。

本研究建立了一种同时检测猪肉氨基比林、安替比林及安乃近代谢物的多残留分析方法，该方法灵敏可靠，完全满足猪肉中氨基比林、安替比林及安乃近代谢物的残留检测要求。

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[11] 中华人民共和国农业部. 关于发布《兽药残留试验技术规范(试行)》的通知[S].

Ministry of agriculture of the People's Republic of China. Notice on the publication of the technical specification for veterinary drug residue test (Trial) [S].