猪源耐黏菌素大肠杆菌PFGE分型及耐药性研究

吴宁鹏，吕小月，于 辉，周 娟

(1.河南省兽药饲料监察所，郑州 450008；2.河南省动物卫生监督所，郑州 450008)

大肠埃希菌(Escherichiacoli),通常称为大肠杆菌，为肠杆菌科，埃氏菌属的革兰氏阴性菌。猪感染大肠杆菌通常引起仔猪肠道传染性疾病，常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和水肿病三种[1]。近年，随着抗菌药物的不当使用，耐药菌株越来越多，耐药问题日趋严重[2]，因此对大肠杆菌进行长期的监测研究工作十分重要。脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)是近年发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术，因其重复性好，分辨力强被誉为细菌分子分型技术的“金标准”，被广泛应用于分子分型研究[3]。通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘关系，对于细菌性传染病的监测、传染源的追踪、传播途径的调查和识别有着非常重要的意义[4]。

碳青霉烯类抗菌药物通常被认为是治疗泛耐药肠杆菌的最后手段，而黏菌素是治疗耐碳青霉烯类病原体感染的关键药物，因此，耐黏菌素的菌株的传播，会严重影响临床治疗的有效性[5]。本研究对2014、2015年分离于河南省焦作市、许昌市养殖场的耐黏菌素大肠杆菌进行PFGE基因分型及耐药性研究，以达到对河南省内耐黏菌素大肠杆菌流行情况的准确判断，从而对耐黏菌素大肠杆菌引起的疾病的防治提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 2014与2015年从河南省焦作市、许昌市规模化养殖厂健康猪或病猪中分离并保存的共333株大肠杆菌中32株耐黏菌素大肠杆菌。沙门菌标准菌株H9812由河南农业大学牧医工程学院微生物实验室提供。

1.1.2 主要仪器和试剂 动物源细菌耐药性药敏检测板，购自上海星佰生物技术有限公司；营养琼脂培养基、脑心浸萃液琼脂培养基，购自北京路桥公司；蛋白酶K、限制性内切酶XbaⅠ购自宝生物工程(大连)有限公司；PFGE专用琼脂糖为Bio-Rad公司配套产品；细胞悬浮液(CSB)、细胞裂解液(CLB)均为新鲜配制；CHEF-MapperXA型脉冲电泳仪、GELDOC凝胶成像系统购自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 使用药敏检测板对32株耐黏菌素大肠杆菌进行药敏试验，结果判定依照美国临床实验室标准委员会推荐的标准。

1.2.2 PFGE分型

1.2.2.1 细菌的培养 将受试菌株和标准菌株H9812划线接种于营养琼脂培养基，37 ℃过夜培养。

1.2.2.2 胶块的制备 挑取适量的过夜培养的新鲜菌落制备菌悬液，加入10 μL的蛋白酶K和200 μL溶化的56 ℃的1% SeaKem Gold 1% SDS琼脂糖。

1.2.2.3 细胞裂解 将胶块于细胞裂解液中(5 mL CLB，25 μL蛋白酶K)裂解，水浴摇床55 ℃，165 r/min孵育5 h。

1.2.2.4 裂解后洗胶 分别用超纯水和TE缓冲液洗涤胶块。

1.2.2.5 酶切 用刀片切下约1/3的小胶块，加入XbaⅠ酶切体系，37 ℃水浴3 h。

1.2.2.6 电泳 弃去酶切体系，将胶块按顺序置于梳子上，倒入溶解的1%的琼脂糖制胶；使用CHEF-mapperXA型脉冲场凝胶电泳仪和0.5×TBE进行电泳。

1.2.2.7 染色与图像的获取 将凝胶置于500 mL含1 μg/mL的EB溶液中染色30 min，然后纯水脱色30 min，用凝胶成像系统Gel Doc获取胶图，并用Bio Numerics软件聚类分析。

2 结果与分析

2.1 药敏试验 32株猪源大肠杆菌分离株对13种临床常用抗菌药物耐药情况见表1。

药敏试验结果表明，32株猪源耐黏菌素大肠杆菌对四环素的耐药性(100%)最为普遍，其次是磺胺异噁唑(96.8%)，多西环素(96.8%)，复方新诺明(90.6%)，耐药率均高达90%以上，对氟苯尼考、氨苄西林、大观霉素、恩诺沙星的耐药率分别为87.5%、84.4%、81.3%、59.4%，均在50%以上，对氧氟沙星(46.9%)、庆大霉素(31.3%)、阿莫西林/棒酸(12.5%)耐药率较低，对头孢噻呋耐药率最低(0)。

2.2 PFGE 32株猪源耐黏菌素大肠杆菌的聚类分析见图1，其中M14～39于2014年分离于许昌，2015M29、2015M31于2015年分离于许昌，2015M32、2015M35、2015M38、2015M39于2015年分离于焦作，分离株共存在30种带型，其中，1、2、3、4带型间相似性在90%以上，各菌株带型间基本无差异，可认为是同一流行亚种，5、6、7、8、9各带型间相似性约为85%，可能存在克隆相关，其他带型相似性均低于85%，说明亲缘关系较远，菌株遗传基因之间不紧密相关，流行病学上可能不存在相关性。

表1 32株猪源大肠杆菌耐药情况Tab 1 Antimicrobial resistance of 32 chicken E.coli isolates

图1 32株耐黏菌素大肠杆菌PFGE聚类分析图Fig 1 The cluster analysis of 32 strains of Colistin resistance E.coli

3 讨论与小结

来自中国、英国和美国多所大学的研究者在期刊《柳叶刀·传染病》上宣布[6]，发现了一种新形式的抗药性，首次在肠杆菌科中发现了质粒介导的黏菌素抗性机制，MCR-1。在此之前，黏菌素耐药性仅由染色体突变介导，从未有过耐药基因水平转移的报道。面对最后的防线之一多粘菌素，而且这种抗药性还在肉用动物和人类中同时存在，可能是因为该药的农业使用。这种抗药性可在细菌之间轻易地转移，而且可能已经蔓延至多个国家。

为了对河南省许昌市、焦作市两规模化养殖场黏菌素耐药菌株作流行病学分析，对分离于两地市的黏菌素耐药大肠杆菌进行药敏试验和分子分型研究，研究发现，32株猪源耐黏菌素大肠杆菌对四环素的耐药性最为普遍，其次是磺胺异噁唑，多西环素，复方新诺明，耐药率均高达90%以上，此外，对氟苯尼考、氨苄西林、大观霉素、恩诺沙星的耐药率均在50%以上，对氧氟沙星(46.9%)、庆大霉素(31.3%)、阿莫西林/棒酸(12.5%)耐药率较低，对头孢噻呋耐药率最低，为0。分离株对多种抗菌药物耐受，耐药谱广，可能与PFGE型较多有关。

脉冲场电泳(PFGE)技术重复性好，特异性、分辨性高，作为一种成功的基因分型方法，广泛应用于各种病原微生物分型和溯源中。在欧美等发达国家中，许多公共卫生实验室采用PFGE技术进行DNA指纹图谱鉴定，确定食源性疾病发生时致病菌的种属[7-8]。美国疾病预防及控制中心(CDC)通过建立细菌基因分型国家电子网络(PulseNet)，将来自各地市的病人或可疑食品样本的细菌PFGE实验结果与全国各地的结果进行比较，根据来自同一亲代的个体具有共同的遗传物质，故可以在PFGE实验中表现出相同的指纹图谱这一原理，确定各地致病菌的亲缘关系，追溯共同的致病食品的源头所在[9-10]。目前美国已应用这种方式成功地查获了多起食源性疾病的源头食品，并通过对生产这些食品的单位进行有效地干预控制[11]，从根本上防止了食源性疾病的发生[12]。

32株耐黏菌素大肠杆菌整体上表现出较大的遗传多样性，但不同菌株存在着不同程度的亲缘关系，其中，带型5中菌株M35和2015M31分别于2014年，2015年分离于许昌，其带型具有较高的同源性，可能是许昌该养殖厂优势流行的菌株，菌株M20与2015M35分别于2014年，2015年分离于许昌和焦作，其带型间相似性约为85%。

综上所述，本研究为猪源耐黏菌素大肠杆菌的流行病学提供了一些本底数据，为今后大肠杆菌的监测提供数据参考，为临床筛选安全敏感抗菌药物，初步建立细菌耐药性流行病学调查数据库及疾病流行和暴发过程中的追踪溯源提供参考。

参考文献：

[1] 曾俊棋，岳万福. 猪源大肠杆菌耐药性与毒力的研究[J]. 现代畜牧兽医. 2016，(1): 38-44.

Zeng J Q, Yue W F. Study on the Resistance and Toxicity ofEscherichiacoliin Swine[J]. Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2016, (1):38-44.

[2] 王克领，张青娴，徐引弟，等. 河南地区猪源性大肠杆菌血清型鉴定与耐药性调查[J]. 河南农业科学, 2014，(9): 164-167.

Wang K L, Zhang Q X, Xu Y D,etal. Serotype Identification and Drug Resistance Investigation of SwineEscherichiacoliin Henan Area[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2014，(9):164-167.

[3] 叶 蕊，石丽媛，王 鹏，等. 脉冲场凝胶电泳技术简介及其在细菌分子分型中的应用[J]. 中国媒介生物学及控制杂志. 2013，(2): 182-185.

Ye R, Shi L Y, Wang P,etal. Brief introduction of pulsed-field gel electrophoresis and its application in bacterial molecular typing[J]. Chinese Journal of Vector Biology and Control. 2013，(2):182-185.

[4] 张惠媛，汪 琦，张 昕，等. 进出境食品中单核增生李斯特菌的血清分型与脉冲场凝胶电泳分型分析[J]. 中国食品卫生杂志, 2012，(5): 407-411.

Zhang H Y, Wang Q, Zhang X,etal. Analysis on pulsed-field gel electrophoresis and serotyping of Listeria monocytogenes isolates from import and export food[J]. Chinese Journal of Food Hygiene, 2012，(5):407-411.

[5] Johnson A P, Woodford N. Global spread of antibiotic resistance: the example of New Delhi metallo-beta-lactamase (NDM)-mediated carbapenem resistance[J]. J Med Microbiol, 2013, 62(Pt4): 499-513.

[6] Liu Y Y, Wang Y, Walsh T R,etal. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biolo￣gical study[J]. Lancet Infect Dis, 2016, 16(2): 161-168.

[7] Felix B, Danan C, Van Walle I,etal. Building a molecular Listeria monocytogenes database to centralize and share PFGE typing data from food, environmental and animal strains throughout Europe[J]. J Microbiol Methods, 2014, 104: 1-8.

[8] Magnusson S H, Guethmundsdottir S, Reynisson E,etal. Comparison of Campylobacter jejuni isolates from human, food, veterinary and environmental sources in Iceland using PFGE, MLST and fla-SVR sequencing[J]. J Appl Microbiol, 2011, 111(4): 971-981.

[9] 游兴勇，刘成伟，朱应飞，等. 江西省食源性沙门菌血清分型及脉冲场凝胶电泳指纹图谱研究[J]. 中国食品卫生杂志, 2014, (6): 528-532.

You X Y, Liu C W, Zhu Y F,etal. Serotyping and PFGE type ofSalmonellaisolates from food in Jiangxi Province[J]. Chinese Journal of Food Hygiene, 2014, (6):528-532.

[10] Bakhshi B, Kalantar M, Rastegar-Lari A,etal. PFGE genotyping and molecular characterization of Campylobacter spp. isolated from chicken meat[J]. Iran J Vet Res, 2016, 17(3): 177-183.

[11] Lytsy B, Engstrand L, Gustafsson A,etal. Time to review the gold standard for genotyping vancomycin-resistant enterococci in epidemiology: Comparing whole-genome sequencing with PFGE and MLST in three suspected outbreaks in Sweden during 2013-2015[J]. Infect Genet Evol, 2017, 54: 74-80.

[12] Murase T, Nakamura A, Matsushima A,etal. An epidemiological study of Salmonella enteritidis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE): several PFGE patterns observed in isolates from a food poisoning outbreak[J]. Microbiol Immunol, 1996, 40(11): 873-875.