针刺对瘙痒模型小鼠延髓β-EP表达的影响

赵一丁,闫婵娟,李文彬

(陕西省中医医院,西安 710003)

瘙痒的定义最早由德国医生Samuel Hafenreffer于350年前提出[1],是一种可引发搔抓意愿和搔抓反射的特异性皮肤感觉,可由多种皮肤疾病和系统性疾病引起,临床医生通常将持续时间超过 6周的瘙痒定义为慢性瘙痒[2],其发生率随年龄的增加而升高,严重影响患者的生活质量。由于瘙痒产生机制复杂,目前尚缺乏可以长期缓解的治疗手段,大量研究证实针刺对瘙痒具有不同程度的抑制作用[3],但作用机制尚不清楚,本研究拟构建瘙痒动物模型,通过针刺穴位,观察模型小鼠延髓β-内啡肽(β-EP)的表达,以期探讨针刺在对瘙痒调控过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康C57B/6J雄性小鼠50只,SPF级,6～8周龄,体重 20～25 g,由西安交通大学医学部实验动物中心提供(许可证号SCXK2012-003)。饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中,室温控制在 18～24℃,湿度控制在50%～70%,光照时间 8:00—20:00,自由饮水进食。实验过程中对实验动物的处置均符合 2006年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 主要仪器

冰冻切片机(德国 LAIKA)、超低温冰箱(日本SANYO)、荧光显微镜(日本OLYMPUS)、台式离心机(美国 Benchmark)、电热恒温培养箱(上海生工生物工程股份有限公司)、蛋白垂直电泳槽(美国Biorad公司)、蛋白湿转仪(美国Biorad公司)、电泳仪(北京六一仪器厂)、摄像机(日本 SONY)、50 μL微注射器、0.25 mm×25 mm华佗牌一次性针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)、微计量器、血管钳、手术刀、眼科剪等。

1.2.2 主要试剂

一 抗 Beta endorphin(66358-1-Ig,美 国Proteintech公司),Beta-actin(SC-47778,美国Santa Cruz Biotechnology公司),羊抗鼠二抗(31430,美国 PIERCE公司),羊抗兔二抗(31460,美国 PIERCE公司)、考马斯亮蓝R-250、Tween20(美国Amresco公司),兔IgG免疫组化试剂盒、抗荧光衰减封片剂、DAPI染色剂(武汉博士德生物工程有限公司),OCT包埋剂(武汉赛维尔生物技术有限公司),NC膜、BCA kit、Supersignalwest pico(美国PIERCE公司),RIPA蛋白裂解液(上海邦奕生物科技有限公司),Cocktail蛋白酶抑制剂(德国Roch公司),98%组胺二磷酸盐,氯喹等。

1.3 动物分组与处理[4-5]

采用随机数字表将50只C57B/6J小鼠随机分为组胺组20只、氯喹组20只和空白对照组10只,其中组胺组和氯喹组又分为针刺组和非针刺组,每组10只。实验前所有小鼠放入透明树脂盒内每天适应1 h,连续3 d。第3天适应结束后将组胺组和氯喹组小鼠颈背部(肩胛连线中点上方约5 mm处)皮肤刮毛。

组胺组小鼠,适应结束后第 1天置于透明树脂盒内适应1 h后于小鼠颈背部刮毛区皮内注射磷酸组胺100 μL/只造模。第2天适应及给药同第1天,给药后针刺组随即进行针刺干预,针刺组取双侧血海、曲池及合谷穴,小鼠穴位定位及针刺深度均参照《实验针灸学》[6],将毫针直刺双侧血海、曲池及合谷穴2.5～3 mm,采用提插和捻转手法刺激,留针时间为20 min,每日1次,共针刺2次。

氯喹组小鼠,适应结束后第 1天置于透明树脂盒内适应 1 h后于小鼠颈背部刮毛区皮内注射氯喹50 μL/只造模。第 2天适应及给药同第 1天,给药后针刺组给予针刺干预,具体同组胺针刺组。

空白对照组:适应结束后不做任何处理，每日进行行为学观察前需适应1 h。

1.4 取材

针刺后各组小鼠腹腔注射 2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉,固定在操作台上,迅速开胸,提拉胸骨柄,完全暴露小鼠心脏,使用6号静脉输液器插入左心室后,用血管钳固定好输液器进针处,并夹闭心脏,剪开右心耳,打开静脉输液器最快滴速注入生理盐水,观察小鼠肝脏及肠管,待肝脏由红色变为白色,肠管鼓胀,四肢及尾部僵直,迅速紧贴小鼠枕骨下用剪刀断头,剔除多余皮肤、肌肉组织,用弯钳剪去颅骨,将大脑沿腹侧剥出并置于冰面上,切除小脑后定位延髓上、下界,取延髓后切半,一半置于冻存管内放入液氮罐中冻存,后移入﹣80℃冰箱中保存,用于 Western blot检测;另一半置于 4%多聚甲醛固定液中固定,经 30%蔗糖溶液脱水4 d,待组织沉底后在冰冻切片机中做水平切片,收集切片于防脱载玻片上,置于切片盒中 4℃冰箱保存用于免疫荧光检测。

1.5 指标检测

1.5.1 行为学观察

各组小鼠均于适应结束后第1天开始放入透明树脂盒子内观察小鼠行为学变化,连续观察3 d。第1天组胺组和氯喹组于第1次颈部皮下注射致痒剂后观察;第2～3天组胺针刺组和氯喹针刺组于针刺后观察,组胺非针刺组和氯喹非针刺组行为学观察时间同第1天。观察过程中保持室内安静无人,摄像机录像40 min,实验结束后回放录像观察小鼠活动情况。瘙痒行为学观察以搔抓次数作为评判方法,具体以小鼠后爪离开盒子底面并搔抓皮肤到其后爪落地或舔舐其后爪为1次完整的搔抓动作,在此期间不管搔抓多少次,均记为 1次[7],由2名不参加实验的工作人员记录小鼠搔抓次数。

1.5.2 免疫荧光检测延髓β-EP能神经元

将制备的延髓组织切片用含 0.3% TritonX-100的PBS洗1次,再用PBS洗3次,每次10 min,用10%羊血清封闭液封闭 30 min,之后甩干净封闭液,晾干;一抗用PBS稀释(1:200),4℃过夜,弃去一抗,用 0.3%TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次10 min;二抗用PBS稀释,室温孵育30 min,用0.3% TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次10 min;用稀释的SABC-FITC室温孵育30 min,0.3% TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次 10 min,用 DAPI染色剂染色 5 min,0.3%TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次10 min,最后加入抗荧光衰减封片剂加盖玻片于荧光显微镜进行观察。

1.5.3 Western blot检测延髓β-EP的表达

取出﹣80℃冰箱保存的延髓组织,称重后在研钵中倒入液氮,研碎组织块后移入 EP管中,在管中加入RIPA蛋白裂解液(3 mL/g)、蛋白酶抑制剂Aprotinin,充分裂解后取上清液置于新 EP管内,冰上保存,将各样品蛋白液1:50稀释,参照BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白测定,每个样品取相同质量的蛋白,加入5×loading buffer后沸水煮10 min使蛋白变性;将制备好的 10%凝胶板放入电泳槽内,倒入 1×running buffer,用细枪头加样,确定加样顺序和计算加样量;将电泳槽与电源连接好,以90 V稳压状态电泳,当溴酚蓝进入分离胶时将电压调整至100 V,待溴酚蓝电泳至分离胶底部停止电泳;按方向依次放好滤纸、胶、膜,直至整个夹板保持紧密,用含5%脱脂奶粉的TBS封闭,可在室温封闭 4 h;结合一抗,在 4℃过夜,HTR2B(1:1000),室温漂洗3次,每次10 min,结合二抗,室温结合 2 h;羊抗鼠二抗(1:10000)、羊抗兔二抗(1:10000),室温漂洗 3次,每次 10 min,最后一次用TBS漂洗以去除吐温;化学发光,于暗室中曝光操作,梯度曝光10 s至5 min。

1.6 统计学方法

数据采用SAS9.3统计软件进行分析处理。计量资料符合正态分布采用均数±标准差表示,两组之间比较采用t检验,多组之间比较采用one-way ANOVA,所有统计检验均采用双侧检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组干预后小鼠搔抓次数比较

组胺组及氯喹组模型动物搔抓次数均明显高于空白对照组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01),可作为成功建立瘙痒模型的指征;针刺对组胺组及氯喹组动物搔抓行为均具有抑制作用,氯喹针刺组搔抓次数低于氯喹非针刺组(P＜0.05),组胺针刺组搔抓次数明显低于组胺非针刺组(P＜0.01),氯喹非针刺组搔抓次数高于组胺针刺组(P＜0.01)。详见表1。

2.2 各组干预后延髓β-EP能神经元表达比较

免疫荧光结果显示,空白对照组及组胺非针刺组延髓β-EP能神经元表达均不明显(见图1 A、E);组胺针刺组延髓β-EP能神经元表达数量略有增加,氯喹针刺组及氯喹非针刺组延髓β-EP能神经元均有一定的表达,延髓β-EP呈点状、条索形或不规则状分布(见图1 B、C、D)。

表1 各组干预后搔抓次数比较 (x ±s,次/40 min)

2.3 各组干预后延髓β-EP蛋白表达比较

Western blot结果显示,氯喹针刺组、氯喹非针刺组及组胺针刺组延髓β-EP表达均明显高于空白对照组(P＜0.01),组胺非针刺组延髓β-EP表达与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),组胺针刺组延髓β-EP表达明显高于组胺非针刺组(P＜0.01),氯喹针刺组与氯喹非针刺组延髓β-EP表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表2、图2。

表2 各组干预后延髓β-EP表达比较 (x±s)

图2 各组干预后延髓β-EP表达

3 讨论

瘙痒是许多皮肤疾病常见而棘手的临床表现,如特应性皮炎、荨麻疹、皮肤瘙痒症、银屑病等。中医学认为瘙痒由风、湿、热、虫、毒之邪气郁于皮肤腠理之间,使其气血不和,肤失濡养,郁生微热所致,或由于血虚风燥阻于皮肤,肌肤失养,内生虚热而发[8-9]。针灸通过穴位刺激可以激发机体的自愈能力,达到疏风解表、清热祛湿、杀虫止痒、调和气血的作用[10-11],本研究取曲池、合谷,属手阳明大肠经,乃多气多血之经,善于开泄,能疏泄蕴于肌肤之邪,达到开腠理、疏风清热止痒的作用,血海属足太阴脾经穴,为血会,具有理血活血、散风除湿的作用,“治风先治血,血行风自灭”。针刺对瘙痒性皮肤病具有很好的疗效及安全性,对于针刺止痒的机制研究主要围绕外周瘙痒介质展开[12-14],针刺对中枢神经元、瘙痒信号及其分子机制尚不清楚。

瘙痒与疼痛同为伤害性刺激,延髓头端腹内侧核作为中枢调制系统中下行抑制系统的重要组成部分,参与多种神经递质对感觉的调控,RVM区神经元在脊髓水平伤害性信号的传导中具有重要的作用[15]。阿片类物质是具有镇痛作用的一类特殊的神经肽,内源性阿片活性物质的代表是内啡肽及强啡肽,广泛分布于中枢和周围神经系统,其中β-EP是由31个氨基酸组成的阿片类物质,β-EP通过与其特异性受体μ-阿片类受体(μ opioid receptor,MOR)结合,可以抑制电压依赖的Ca2﹢通道开放和腺苷环化酶活化,同时激活K﹢通道,降低神经细胞兴奋性,从而抑制痛觉[16-18],同时 MOR的异构体 MOR1D(morphine receptor-1D)与胃泌素释放肽受体形成异二聚体,传导瘙痒信号产生痒觉[19]。

本研究结果显示针刺对组胺致痒及氯喹致痒动物模型搔抓行为均具有抑制作用,对组胺致痒动物模型延髓β-EP的表达具有明显的上调作用,对氯喹致痒动物模型β-EP的表达影响不明显,但氯喹致痒动物模型β-EP表达明显高于空白对照组,说明无论针刺与否β-EP均参与氯喹诱导的非组胺依赖性瘙痒的产生。而组胺致痒动物模型延髓β-EP的表达与针刺密切相关,这可能与针刺诱发模型动物痛觉产生有关,有研究显示,辣椒素局部注射可引起痛觉过敏,在出现痛觉过敏的皮肤内注射致痒剂,可发现瘙痒强度减低,痒觉超敏和痒觉过敏消失[20],亦有研究显示破坏大鼠脊髓背角瘙痒相关神经元可以减少慢性疼痛和痛觉过敏[21-24],均反映了疼痛和瘙痒可能共用—部分神经通路,故本研究中针刺诱发疼痛使β-EP表达反馈性增加,同时抑制痒觉的产生,存在疑问的是本研究中β-EP的表达增加没有引起搔抓行为的增加,可能与针刺穴位、手法、刺激量、刺激时间均存在联系,有待进一步深入研究。

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