HE 4在上皮性卵巢癌中的表达情况及其与临床特征及预后的关系分析

党秋红，曹静，张欢欢，曾宪旭，靳耀锋

1郑州大学第三附属医院病理科，郑州450052

2西安交通大学第二附属医院病理科，西安710004

卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，且其组织成分复杂，是类型最多的原发性肿瘤，包括上皮性肿瘤、性索/间质肿瘤和生殖细胞肿瘤等，其中上皮性卵巢癌所占比例最大[1]。卵巢癌的发病一般比较隐匿，多数患者确诊时已是肿瘤晚期，预后相对较差，故寻找一种可靠的早期诊断方法十分重要[2]。卵巢癌的诊断有多种方法，包括妇科三合诊（阴道、直肠及腹部），经阴道多普勒彩色超声，影像学检查如CT、MRⅠ、正电子发射断层扫描（positron emission tomography，PET）等，以及肿瘤标志物检测如糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）及CA19-9等[3]。其中CA125检测是卵巢癌最常见的早期筛查方法，尤其是上皮性卵巢癌患者对其更为敏感，但其对组织的特异度相对较差，且对早期肿瘤的敏感度有限，故寻找一种高敏感、高特异度的新型肿瘤标志物是所有妇科肿瘤研究者的重要目标[4]。人附睾上皮分泌蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）是一种分泌型糖蛋白，在各种恶性肿瘤组织中均异常表达，提示其与肿瘤的发生发展有密切的关系[5]。本研究采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELⅠSA）和免疫组织化学法（immunohistochemistry，ⅠHC）检测卵巢癌组织中HE4的表达情况，分析其与临床特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年3月至2014年3月于郑州大学第三附属医院诊治的150例上皮性卵巢癌患者和72例良性卵巢疾病患者的临床资料。纳入标准：①上皮性卵巢癌患者的临床表现和病理学检查结果均符合上皮性卵巢癌的诊断（依据《妇产科学》第7版[6]）；②上皮性卵巢癌患者均于郑州大学第三附属医院首诊，且术前未经任何放化疗；③病历资料完整。排除标准：①依从性差；②放化疗过敏；③有手术绝对禁忌证。150例上皮性卵巢癌患者的年龄为24～68岁，平均为（42.32±9.05）岁；依据1988年国际妇产科联盟（FⅠGO）分期标准[7]，病理分期：Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期72例。72例良性卵巢疾病患者的年龄为22～65岁，平均为（41.73±9.79）岁。两组患者的年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 检测方法

HE4兔抗人单克隆抗体（一抗）购于美国Abcam公司，抗兔抗体（二抗）和DAB酶底物显色剂购于美国Dako公司，HE4 ELⅠSA试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。

1.2.1 ELISA法检测血清HE 4水平 收集治疗前后上皮性卵巢癌和良性卵巢疾病患者的空腹静脉血5 ml，置于EDTA抗凝管中，3000 r/min离心5 min，取上清。然后采用ELⅠSA法检测两组患者的血清HE4水平，所有操作均严格按照试剂盒操作说明书进行。

1.2.2 IHC法检测肿瘤组织中HE 4表达情况 ⅠHC的原理是一种抗原抗体反应，可用于蛋白的定位、定性及相对定量的研究，该技术被广泛应用于肿瘤诊断，是发现肿瘤最新蛋白最实际的“金标准”。本研究采用ⅠHC法检测HE4在150例上皮性卵巢癌患者的癌组织和相应癌旁正常组织中的表达情况，具体步骤如下：①烤片，常规石蜡切片，切片厚度为3～5µm，60℃烤片3～4 h。②脱蜡入水，二甲苯脱蜡2遍，各10 min；梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）脱二甲苯入水，各3 min；蒸馏水洗3遍，各3 min。③内源性过氧化物酶阻断，H2O2加甲醇，10 min，注意避光。④抗原修复，玻片标本置于盛有柠檬酸修复液的高压锅中，电磁炉加热至沸腾，改档并保持在130 kW，15 min，然后自然冷却至常温，30～40 min；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗3遍，各3 min。⑤添加一抗，滴加兔抗人HE4多克隆抗体（一抗）（1∶100稀释），4℃湿盒内过夜；PBS洗3遍，各4 min。⑥添加二抗，37 ℃湿盒内孵育15～20 min；PBS洗3遍，各4 min。⑦二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，添加DAB酶底物显色剂，显微镜下观察，控制显色反应1 min左右，蒸馏水洗2遍，各4 min。⑧苏木素复染、封片，将玻片置于苏木素染色液进行复染1 min（每次需要将漂浮的氧化膜去掉），然后用流水冲洗5～7 min，再放入梯度乙醇（95%、85%、75%）中各1 min，二甲苯透明，中性树胶封片。

HE4蛋白阳性表达为细胞质呈黄色或棕黄色。判定方法采用双盲法[8]：染色强度×阳性细胞百分比。在同一个物镜视野下，一位病理科高级职称医师负责染色强度判断：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；另一位病理科高级职称医师负责阳性细胞计数：未见阳性细胞为0分，阳性细胞占所有细胞百分比≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度×阳性细胞百分比≥3分为HE4蛋白阳性表达。

1.3 随访方法

上皮性卵巢癌患者的随访时间截至患者死亡或2017年3月，随访时间为36个月，随访方式包括电话随访、上门随访和门诊复诊等，了解患者的生存情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析或SNK-q检验；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验；绘制生存曲线采用Kaplan-Meier法，生存率比较采用Logrank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清HE 4水平

Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌患者的血清HE4平均水平分别为（216.93±57.39）、（245.19±63.28）pmol/L，均明显高于良性卵巢疾病患者的（164.06±50.17）pmol/L，差异均有统计学意义（P＜0.01）；且Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌患者的血清HE4平均水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 HE 4蛋白的表达情况

上皮性卵巢癌患者的癌组织中HE4蛋白的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 上皮性卵巢癌患者的癌组织与相应癌旁正常组织中HE 4蛋白阳性表达率的比较

2.3 上皮性卵巢癌组织HE 4蛋白表达与临床特征的关系

肿瘤直径＞3 cm、低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的上皮性卵巢癌组织HE4蛋白的阳性表达率分别高于肿瘤直径≤3 cm、中高分化、Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的癌组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征的上皮性卵巢癌患者HE 4蛋白的阳性表达率的比较

2.4 上皮性卵巢癌患者的HE 4蛋白表达与生存情况的关系

随访36个月，HE4蛋白阳性表达的上皮性卵巢癌患者的生存率为22.08%，低于阴性表达患者的 60.17%，差异有统计学意 义（χ2=7.946，P=0.028）。（图1）

3 讨论

图1 HE 4阳性、阴性表达的上皮性卵巢癌患者的生存曲线图

HE4蛋白是WFDC2基因的产物，该基因位于染色体20q12-13.1上，属于WAP家族。近年，有研究显示HE4在早、晚期卵巢癌患者的诊断和鉴别诊断中具有较高的特异度和灵敏度[9]。Moore等[10]发现，HE4在早期卵巢癌诊断和鉴别诊断中的灵敏度优于CA125，与其他肿瘤标志物比较，HE4蛋白是最佳的单项检测指标，但若其与其他标志物（CA125最佳）联合，卵巢癌诊断的敏感度和特异度最高。有研究证明，HE4在卵巢癌组织中特异度高，良性卵巢组织中低，且与临床特征及预后有密切的关系，有望成为早期诊断和监测卵巢癌预后的重要指标[11]。本研究中，上皮性卵巢癌患者的血清HE4水平明显高于良性卵巢疾病患者，上皮性卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期患者的血清HE4水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05），说明HE4不仅可鉴别良性卵巢疾病与上皮性卵巢癌，还可较好地反映肿瘤的发展趋势。本研究还发现，HE4表达情况与肿瘤直径、分化程度、FⅠGO分期及有无淋巴结转移有关（P＜0.05），说明HE4表达与肿瘤的恶性程度、转移有关，这与庄慧宇等[12]的研究结果基本一致，提示HE4有望成为上皮性卵巢癌患者早期诊断、个体化治疗的重要指标。此外，本研究还发现，HE4蛋白阳性表达的上皮性卵巢癌患者的生存率低于阴性表达的患者，差异有统计学意义（P＜0.05），这与王静等[13]的研究结果基本一致，提示HE4在监测上皮性卵巢癌的预后方面有一定的研究意义。综上所述，HE4是上皮性卵巢癌的良好肿瘤标志物，与肿瘤的良、恶性及临床特征有密切的关系，对上皮性卵巢癌患者的早期诊断及预后有一定的价值。

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