下调EZH 2基因对胃癌细胞株SGC7901增殖作用的影响

万倩，邓野，李弦，王丹，杨继元#

1长江大学附属第一医院肿瘤科，湖北 荆州434000

2荆州市第一人民医院中心实验室，湖北 荆州434000

胃癌是常见的恶性肿瘤，在中国发病率居恶性肿瘤的第3位[1]。中国胃癌防治的现状是“一高三低”：发病、病死率高，早期诊断率低，手术根治率低，5年生存率低。尽管近年来胃癌的病死率有所下降，但仍严重威胁着人类的生命健康。中国胃癌患者往往因非特异性的消化道症状导致早期就诊率低，大多数患者确诊时已是晚期，错过最佳手术时机，因此在基因层面研究在胃癌发生、发展、增殖中起调控作用的基因是必要的。zeste基因增强子同源物 2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是PcG基因家族中PRC2复合物的催化活性亚单位，与果蝇基因同源，它定位于人染色体7q35位置上[2]，通过催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27m3）参与表观遗传学和基因表达的调控[3]。多项研究显示，EZH2基因在许多肿瘤中都存在着过表达，并与肿瘤的生物学行为有关，如胃癌[4]、乳腺癌[5]等。这使其可能成为一个重要的早期诊断、评价预后的分子指标，更有可能成为肿瘤的靶向治疗的新靶点。本研究以靶向干扰下调EZH2基因的表达后，观察EZH2基因对胃癌细胞发生、发展、增殖调控的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SGC7901细胞、RPMⅠ1640培养基、含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）胰蛋白酶、青霉素-链霉素均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清购自四季青公司；磷酸盐缓冲液（PBS）由荆州市第一人民医院中心实验室保存；Lipo6000TM转染试剂、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、RⅠPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、CCK-8试剂盒、焦碳酸乙二酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）、Tween-20、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、Beyo ECLPlus化学发光检测试剂、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、Tris-HCL、过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）、苯甲磺酰氟（phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF）、30%Acr-Bis、RNAeasy™动物总RNA抽提试剂盒（离心柱式）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、BeyoFast SYBR Green qPCR Mix、cDNA第一链合成试剂盒、蛋白分子量标准品、增强型CCK-8试剂盒均购自碧云天生物技术公司；三羟甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、甘氨酸、异丙醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；EZH2siRNA、EZH2引物、GAPDH引物均由百奥迈科生物技术公司合成，详见表1；兔抗人EZH2多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔多克隆抗体购自美国GeneTex公司，兔抗β-actin多克隆抗体、抗体稀释液购自武汉安特捷生物技术有限公司。

表1 EZH 2干扰RNA序列片段

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将SGC7901细胞接种在有RPMⅠ1640培养基（含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗）的培养瓶中，于37℃、5%CO2恒温饱和湿度培养箱中培养2～3 d后，倒置显微镜下观察细胞呈致密单层后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 细胞转染 根据Genebank提供的EZH2基因序列（ⅠD：2146），使用在线设计软件，通过基因序列比对，合成3条特异性EZH2siRNA。取对数生长期胃癌SGC7901细胞，以每孔1×105个接种于六孔板中，当细胞汇合率达到55%～65%时按照Lipo6000TM转染试剂说明书进行转染步骤对上述3对EZH2siRNA片段（EZH2siRNA-1、EZH2siRNA-2、EZH2siRNA-3）进行转染，同时设立阴性对照组（转染非特异性siRNA片段）和空白对照组（不转染siRNA片段）。每孔siRNA为100 pmol，Lipo6000TM转染试剂用量为5 μl，转染后置入培养箱，6 h后换液，继续培养24～72 h后收集细胞。

1.2.3 细胞总RNA的抽提及qRT-PCR检测 将转染后48 h的各组细胞按照RNA抽提试剂盒和逆转录试剂盒说明书进行RNA的抽提和逆转录。紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度（OD260/OD280），置于-80℃冰箱保存。将总RNA逆转录为cDNA，以各组cDNA为模板对EZH2基因和内参GAPDH进行实时荧光定量PCR反应，优化实时定量多聚酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）反应体系及条件，qRT-PCR反应体 系 为 20 μl，其 中 Beyo Fast SYBR Green qPCR Mix 10 μl、上下游引物各 0.5 μl、模板 2 μl、灭菌水7.2 μl，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃ 15 s，56℃15 s，72℃15 s，40个循环扩增后进行高分辨溶解曲线，每组设3个复孔。EZH2引物序列上游：5'-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3'，下 游 ：5'-TGTGTTGGAAAATCCAAGTCA-3'。GAPDH上游：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，下游：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。实验结果采用 2-△△Ct法计算各组EZH2mRNA表达水平的相对值，选取干扰效果最好的EZH2siRNA片段进行后续实验。

1.2.4 蛋白质印迹法 取EZH2siRNA组、阴性对照组和空白对照组共3种细胞，将细胞用RⅠPA裂解液和PMSF处理，冰上孵育30 min，4℃12 000 rpm离心15 min，得上清蛋白。用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。根据蛋白大小灌制10%分离胶和5%浓缩胶，每泳道上样20 μl，电泳后湿转法至PVDF膜，根据蛋白大小将膜剪开，用含5%脱脂奶粉的TBST液（封闭液）封闭PVDF膜，室温摇床封闭1 h后，将PVDF膜浸在一抗兔抗人EZH2多克隆抗体（1∶1000）中4℃孵育过夜，对照孵育一抗兔抗β-actin多克隆抗体（1∶5000），TBST 洗涤PVDF膜3次，每次10 min，再将PVDF膜浸在用封闭液稀释的HRP标记的羊抗兔二抗（1∶5000）中，室温摇床孵育1 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，通过增强型化学荧光显色（enhanced chemiluminescence，ECL）法进行显影。

1.2.5 CCK- 8法检测细胞增殖能力 将传代4～6代的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后计数，按每孔加入100 μl 2000个细胞的浓度接种96孔板，置37℃，5%CO2培养箱中培养18 h。更新培养基后培养2 h，设置空白对照组（有细胞培养液和CCK-8溶液而无细胞）、阴性对照组（有细胞和CCK-8溶液而未转染混合物）、siRNA组（有细胞、CCK-8溶液及转染混合物），每组设3个复孔，分别于转染后24、48、72、96 h每孔加入CCK-8溶液10 μl，在细胞培养箱内继续孵育1 h，酶标仪检测450 nm处吸光度OD值。每组细胞测3个孔，取平均值，绘制细胞生长曲线。所有实验均重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统-计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后EZH 2 mRNA的表达水平

胃癌细胞SGC7901转染EZH2siRNA后，经实时荧光定量PCR仪检测EZH2mRNA的表达，结果显示，以空白对照组为内参，siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组EZH2mRNA的相对表达量分别为（0.41±0.19）、（0.22±0.15）、（0.47±0.28），均低于阴性对照组的（1.11±0.38），差异均有统计学意义（P=0.008、0.002、0.011），其中siRNA-2组EZH2mRNA相对表达量最低，即EZH2siRNA-2组干扰效果最强，用于后续实验。阴性对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P=0.458）。（图1）

图1 各组胃癌SGC7901细胞转染siRNA后EZH 2 mRNA的相对表达量

2.2 转染后EZH 2蛋白表达水平

SGC7901胃癌细胞转染最佳干扰RNA片段后，经Western blot法检测EZH2蛋白相对表达量，结果显示，空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组的EZH2蛋白相对表达量分别为（0.362±0.026）、（0.398±0.036）、（0.036±0.017），3组比较，差异有统计学意义（F=157.745，P＜0.01）。（图2）

图2 胃癌SGC7901细胞转染后EZH 2蛋白表达水平

2.3 下调EZH 2基因对胃癌细胞SGC7901增殖的影响

采用CCK-8法检测下调EZH2表达后SGC7901细胞的增殖能力。相比于空白对照组和阴性对照组，siRNA组SGC7901细胞的增殖能力减弱，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2、图3）

表2 SGC7901细胞转染siRNA后随时间变化的细胞增殖力（OD450，±s）

表2 SGC7901细胞转染siRNA后随时间变化的细胞增殖力（OD450，±s）

组别空白对照组阴性对照组siRNA组24 h 0.22±0.13 0.25±0.15 0.18±0.08 48 h 0.39±0.19 0.35±0.13 0.20±0.09 72 h 0.42±0.23 0.40±0.26 0.21±0.14 96 h 0.65±0.32 0.63±0.35 0.39±0.14

图3 SGC7901细胞转染EZH 2 siRNA后的细胞增殖能力

3 讨论

胃癌进展是多因素、多阶段及多基因变异的综合病变过程，主要是由端粒酶激活、抑癌基因失活和癌基因激活等引发[6]。Chen等[7]研究显示胃癌组织中的EZH2阳性表达率为56.6%，且与肿瘤体积、浸润层次、淋巴结转移、血行转移及临床恶性程度呈正相关，表明EZH2基因在胃癌的发生发展中有重要作用。另外，He等[8]对117例胃癌组织及其相应的正常组织中EZH2蛋白的水平进行了分析，结果显示：在70.1%的胃癌组织中，EZH2的表达阳性，而正常的胃黏膜上皮细胞中，只有5.4%是EZH2表达阳性，且EZH2高表达患者的平均总生存期（25.2个月）和无病生存期（20.2个月）均短于EZH2低表达的患者（40.5、35.9个月）。该结果说明EZH2可作为胃癌患者预后效果的预测和评估指标。

有研究表明，EZH2表达下调抑制细胞增殖是通过Wnt/β-catenin通路来实现的，在人肾癌ACHN细胞中下调EZH2基因表达抑制细胞增殖和侵袭的同时Wnt3a和β-catenin蛋白的表达也下调，相反Wnt/β-catenin通路阻滞药糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表达会显著提高[9]，但在胃癌中的研究甚少。

本研究着重从细胞层面探讨了EZH2对胃癌细胞系SGC7901的细胞增殖调控作用。通过对细胞进行siRNA转染，以实现对细胞的EZH2基因沉默，并通过荧光定量PCR以及蛋白质印迹实验，证实了EZH2的基因下调。在此基础上，siRNA组的SGC7901细胞，其增殖能力较对照组下降，这也与以往的研究结果一致[9-12]。上述实验证据说明，EZH2的基因下调抑制了SGC7901胃癌细胞系的细胞增殖，EZH2基因在胃癌的发生发展中有着重要意义，为胃癌基因治疗提供一定的理论基础，但其作用通路及机制还有待进一步研究。

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