PI 3K/AKT信号通路阻断药联合小檗碱对前列腺癌DU145细胞生长的抑制作用

凡治国，李志平，任超

安阳市肿瘤医院普内科，河南 安阳455000

目前，前列腺癌的治疗方式主要有内分泌疗法、化疗和放疗[1-2]。研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phosphatei-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PⅠ3K/AKT）信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关，能够参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等多种生物学过程，在肿瘤细胞放疗和化疗的拮抗中起重要作用[3-4]。小檗碱又名黄连素，是一种季胺型异喹啉类生物碱，主要存在于小檗科、毛莫科黄连属等植物中。小檗碱具有清热解毒和消炎的作用，传统中医常用于治疗胃肠道疾病[5]，其对糖尿病和心血管疾病等也具有较好的疗效[6-7]。另外，有研究表明，小檗碱对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用[8]。本研究探讨了PⅠ3K抑制药——LY294002联合小檗碱对前列腺癌DU145细胞生长的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人前列腺癌DU145细胞购自中国科学院细胞库，小檗碱、LY294002购自Sigma公司，RPMⅠ1640培养基购自Ⅰnvitrogen公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Gibco公司，PⅠ3K、p-AKT、cyclin D1、bcl-2和BAX单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗购自美国Abcam公司，MTT试剂盒购自Promega生物技术有限公司，Annexin-V-FⅠTC/PⅠ细胞凋亡检测试剂盒购自生工生物工程有限公司，RNase A购自Solarbio公司，蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。CO2培养箱、全自动酶标仪购自Thermo Fisher公司，倒置显微镜购自日本尼康公司，流式细胞仪购自Beckman Coulter公司，蛋白化学发光凝胶成像系统FluorChem E购自美国Protein Simple公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 从液氮罐中取出装有前列腺癌DU145细胞的冻存管，放入37℃恒温水浴锅中快速解冻，待细胞完全溶解后，在超净台中用移液枪将细胞转移至5 ml无菌离心管中，加入含有10%FBS的RPMⅠ1640细胞培养液，离心弃上清。加入新的细胞培养液重悬细胞，接种到细胞培养皿中，置于37℃5%CO2培养箱中培养。待细胞融合度达到80%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化、离心、收集细胞，按1∶4的比例进行传代培养。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的DU145细胞，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后，加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集细胞，计数并调整细胞浓度，以5×105/孔接种于96孔板中，置于37℃5%CO2培养箱中培养24 h后，更换为含小檗碱及LY294002的细胞培养液培养。将细胞分为两组：小檗碱组，用含小檗碱的细胞培养液单独处理细胞；小檗碱+LY294002组，用含小檗碱和LY294002的细胞培养液联合处理细胞。小檗碱组：小檗碱浓度分别为10、20、40、80 μmol/L；小檗碱+LY294002组：10 μmol/L的LY294002分别与10、20、40、80 μmol/L的小檗碱联合作用；另外，每组均设空白对照（不加药物处理）。培养48 h后，每个浓度处理组选择6孔细胞，每孔加入体积分数为0.5%的MTT溶液20 μl，继续培养4 h后加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液 150 μl，低速振荡10 min，待蓝紫色结晶完全溶解后，用调零孔调零。采用全自动酶标仪在490 nm波长处测定细胞的OD值，并计算细胞增殖率。细胞增殖率=实验组细胞OD490/对照组细胞OD490×100%。

1.2.3 Annexin V/PI荧光双染法检测细胞凋亡取对数生长期的DU145细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，将细胞浓度调整至1×106/ml，每孔2 ml接种于6孔细胞培养板中，置于37℃5%CO2培养箱中培养24 h，更换为分别含80 μmol/L小檗碱（小檗碱组）、10 μmol/L LY294002+80 μmol/L小檗碱（小檗碱+LY294002组）、不含LY294002和小檗碱（空白对照组）的细胞培养液继续培养，每组设6个复孔。作用48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化、PBS清洗、离心收集细胞。每孔加入500 μl Binding buffer重悬细胞，将细胞浓度调整至1×106/ml；取1 ml细胞悬液加入10 μl Annexin V-FⅠTC和10 μl碘化丙锭（propidium iodide，PⅠ），室温避光孵育20 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 取数生长期的DU145细胞，用含有80 μmol/L小檗碱（小檗碱组）、10 μmol/L LY294002+80 μmol/L小檗碱（小檗碱+LY294002组）及不含LY294002和小檗碱（空白对照组）的细胞培养液分别处理48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞。PBS洗涤后，加入体积分数为75%的乙醇，4℃固定过夜。1500 r/min离心5 min，收集细胞，300 μl PBS重悬后，加入150 μl RNase A（10 mg/ml）和50 μl P（Ⅰ1 mg/ml），4℃避光孵育20 min，采用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达情况 取对数生长期的DU145细胞，用含有80 μmol/L的小檗碱（小檗碱组）、10 μmol/L LY294002+80 μmol/L 小檗碱（小檗碱+LY294002组）及不含LY294002和小檗碱（空白对照组）的细胞培养液分别处理48 h后，用PBS洗涤细胞2次，0.25%的胰蛋白酶消化细胞，1000 r/min离心5 min收集细胞。加入300 μl细胞裂解液和3 μl蛋白酶抑制药，冰上裂解30 min，离心取上清。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定总蛋白浓度，用PBS将各蛋白样品浓度调至统一后与5×SDS PAGE上样缓冲液充分混合，100℃煮沸变性5 min。配置8%的SDS蛋白凝胶进行电泳，电泳结束后取出蛋白凝胶，4℃转印至PVDF膜上，用5%BSA封闭后，TBST洗涤3次，然后依次与一抗（500倍稀释）、二抗（100倍稀释）孵育后，滴加化学发光剂ECL显色，用蛋白化学发光凝胶成像系统采集图像，分析蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小檗碱单用及与LY294002联用对DU145细胞增殖的影响

采用MTT法检测不同浓度的小檗碱单用及与10 μmol/L的LY294002联用处理DU145细胞48 h后，对细胞增殖的影响，结果显示：小檗碱组中，10、20、40、80 μmol/L小檗碱分别处理后DU145细胞的增殖率均较空白对照（0 μmol/L小檗碱）低，且随着小檗碱作用浓度的增加，细胞增殖率逐渐降低，呈剂量依赖性。10、20、40、80 μmol/L小檗碱与10 μmol/L的LY294002联用后，对DU145细胞增殖的抑制作用较相同浓度小檗碱单独处理时增强，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1）

图1 小檗碱单用及与LY294002联用对DU145细胞增殖的影响

2.2 小檗碱单用及与LY294002联用对DU145细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪检测80 μmol/L小檗碱单用及与10 μmol/L LY294002联用处理DU145细胞48 h后，对细胞凋亡的影响，结果显示：小檗碱组、小檗碱+LY294002组、空白对照组DU145细胞的凋亡率分别为（27.50±1.25）%、（39.47±3.65）%、（7.56±0.51）%。与空白对照组相比，小檗碱组DU145细胞的凋亡率增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。小檗碱与LY294002联用后，对DU145细胞凋亡的诱导作用明显增强，与小檗碱组和空白对照组相比，小檗碱+LY294002组DU145细胞的凋亡率增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。（图2）

图2 小檗碱单用及与LY294002联用对DU145细胞凋亡的影响

2.3 小檗碱单用及与LY294002联用对DU145细胞周期的影响

采用流式细胞仪检测80 μmol/L小檗碱单用及与10 μmol/L LY294002联用处理DU145细胞48 h后，对DU145细胞周期的影响，结果显示：与空白对照组相比，小檗碱组的G0/G1期DU145细胞所占比例升高，S期DU145细胞所占比例降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；空白对照组与小檗碱组的G2/M期DU145细胞所占比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。小檗碱与LY294002联用后，对DU145细胞周期的阻滞作用增强，与小檗碱组和空白对照组相比，小檗碱+LY294002组G0/G1期细胞所占比例升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 小檗碱单用及与LY294002联用对DU145细胞周期的影响（%，±s）

表1 小檗碱单用及与LY294002联用对DU145细胞周期的影响（%，±s）

注：a与空白对照组比较，P＜0.05；b与小檗碱单独处理组比较，P＜0.05

组别空白对照组（n=6）小檗碱组（n=6）小檗碱+LY294002组（n=6）42.31±3.48 61.56±5.21a 74.19±5.69a b 24.48±2.19 20.81±2.94 17.59±2.76 33.21±3.18 17.63±2.51a 8.22±1.98a G0/G1期G2/M期S期b

2.4 小檗碱单用及与LY294002联用对PI 3 K和p-AKT蛋白表达的影响

采用Western blot检测DU145细胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白表达变化，结果显示：空白对照组DU145细胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白均呈高表达；小檗碱组DU145细胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白表达水平均较空白对照组下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）；小檗碱+LY294002组DU145细胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白表达水平均较小檗碱组和空白对照组下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。（图3）

图3 小檗碱单用及与LY294002联用对ⅠP 3 K和p-AKT蛋白表达的影响

2.5 小檗碱单用及与LY294002联用对cyclin D 1、bcl- 2和BAX蛋白表达的影响

采用Western blot检测DU145细胞中cyclin D1、bcl-2和BAX蛋白表达情况，结果显示：小檗碱组DU145细胞中cyclin D1和bcl-2蛋白表达水平均较空白对照组下调，BAX蛋白表达水平均较空白对照组上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与小檗碱组和空白对照组相比，小檗碱+LY294002组DU145细胞中cyclin D1和bcl-2蛋白表达均下调，BAX蛋白表达上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图 4）

图4 小檗碱单用及与LY294002联用对cyclin D 1、bcl- 2和BAX蛋白表达的影响

3 讨论

小檗碱是主要存在于小檗科、毛莫科等植物中的季胺型异喹啉类生物碱，具有清热解毒和消炎的作用，传统中医常用于治疗胃肠道疾病，能够通过改善胃肠道微生物菌群结构及减轻炎性反应发挥抗代谢紊乱的作用[9]。近年来研究表明，小檗碱具有抗肿瘤作用，如在宫颈癌中，李娜等[10]研究发现，小檗碱能够抑制宫颈癌HeLa细胞的体外增殖，减弱细胞的侵袭和转移能力。温纯洁[11]研究发现，小檗碱可以协同他莫昔芬抑制乳腺癌MCF-7细胞和MCF-7/TAM细胞增殖，诱导细胞凋亡和细胞G1期阻滞，从而抑制乳腺癌的生长。此外，小檗碱还能在胃癌[12]、肺癌[13]、结肠癌[14]等多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用。本实验以前列腺癌DU145细胞为实验材料，研究了小檗碱对DU145细胞生长的影响，结果显示10、20、40、80 μmol/L的小檗碱均能够抑制DU145细胞增殖，且呈剂量依赖性。进一步用80 μmol/L小檗碱研究其对DU145细胞凋亡的影响，结果显示小檗碱能够诱导DU145细胞凋亡，并将细胞阻滞于G0/G1期，说明小檗碱能够抑制DU145细胞的生长。

已有研究证实多条信号通路参与恶性肿瘤的发生、发展，如MAPK信号通路[15]、JAK/STAT信号通路、NF-κB信号通路[16]等。PⅠ3K/AKT属于酪蛋白激酶受体型信号转导通路，近年来研究表明，PⅠ3K/AKT信号通路在细胞的增殖及血管生成中具有重要作用，PⅠ3K/AKT信号通路激活能够促进细胞的生长、抑制细胞的凋亡，与多种肿瘤的发生相关[17]。相关研究还发现，抑制PⅠ3K/AKT信号通路能够增强癌细胞对放疗及化疗的敏感性[18]。本研究采用PⅠ3K抑制药——LY294002抑制PⅠ3K/AKT信号通路，发现LY294002与小檗碱联用能够提高小檗碱对DU145细胞增殖的抑制作用，同时能够提高DU145细胞的凋亡率及对细胞周期阻滞情况，提示抑制PⅠ3K/AKT信号通路能够提高小檗碱对前列腺癌的治疗效果。本研究还采用Western blot法检测了DU145细胞中PⅠ3K和p-AKT蛋白的表达水平，结果显示，与空白对照组相比，小檗碱能够抑制PⅠ3K和p-AKT蛋白的表达水平，说明小檗碱能够抑制PⅠ3K/AKT信号通路的激活；当LY294002与小檗碱联用后，与小檗碱单独作用时相比，PⅠ3K和p-AKT蛋白表达水平均下调，表明LY294002能够增强小檗碱对PⅠ3K/AKT信号通路的抑制作用。

cyclin D1是重要的细胞周期调控因子，目前研究显示，cyclin D1过表达能够造成细胞异常增殖及细胞周期调节失控，与多种肿瘤的发生相关[19]。bcl-2基因家族在通过线粒体途径调控细胞凋亡中具有重要的作用，其中bcl-2的主要功能是抑制细胞凋亡，BAX的主要功能是促进细胞凋亡，bcl-2和BAX能够形成异源或同源二聚体调节细胞的凋亡[20]。本研究采用Western blot法检测发现，小檗碱能够抑制DU145细胞中cyclin D1和bcl-2蛋白的表达，促进BAX蛋白的表达，表明小檗碱影响DU145细胞增殖、凋亡和细胞周期与其能够调控cyclin D1、bcl-2和BAX蛋白的表达相关。进一步研究发现，当小檗碱与LY294002联用后，DU145细胞中cyclin D1和bcl-2蛋白表达均下调，BAX蛋白表达上调，与小檗碱单独处理时相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，小檗碱能够抑制DU145细胞增殖，并促进细胞凋亡和细胞周期阻滞，采用LY294002阻断PⅠ3K/AKT信号通路能够明显增强小檗碱对前列腺癌DU145细胞生长的抑制作用。

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