ubiquilin 4相互作用蛋白的鉴定△

黄声凯，王佳，李燕，李渊，林虹，李东东，崔婵娟，王国婧，赵玫，黄常志#

国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院1检验科，3病因室/分子肿瘤学国家重点实验室/癌发生及预防分子机理北京市重点实验室，北京100021

2煤炭总医院检验科，北京100028

泛素-蛋白酶体降解途径异常会导致人体发生多种疾病，包括神经退行性疾病、病毒感染性疾病以及癌症等[1]。癌细胞产生的蛋白质能够促进细胞的存活和增殖，或抑制细胞的凋亡，这为泛素蛋白酶体系统抑制药的临床试验奠定了基础，泛素蛋白酶体系统抑制药就是将这种细胞调控平衡转变为细胞死亡[2]。大量关于蛋白酶体抑制药的临床试验已经处于二期或三期研究阶段[3-6]，相信在不远的将来会有更多相应的药物被开发。泛醌蛋白（ubiquilin，UBQLN）包括 ubiquilin 1、ubiquilin 2和ubiquilin 4，属于泛素类蛋白家族，是泛素蛋白酶体降解过程中的主要调控因子。UBQLN最广泛的功能是调控泛素蛋白降解系统，其通过一个C端泛素相关结构域（ubiquitin associated domain，UBA）识别与结合多泛素化的底物蛋白，并通过一个N端泛素样结构域（ubiquitin like domain，UBL）将它们传递给蛋白酶体系统[7]。目前，已有关于UBQLN在自噬和内质网降解过程中的相关报道[8-10]。UBQLN被描述为适配器样蛋白，其作用是将泛素化底物转运至蛋白酶体[11-12]。其中，UBQLN4隶属于UBQLN家族[13]，编码ubiquilin 4蛋白。其中，ubiquilin 4包含4个重复的可压力介导的热休克伴侣蛋白结合结构域（stress-inducible protein-1_heat shock chaperonin-binding，STⅠ1_HS-bd），已有研究证明，前端的两个STⅠ1可结合含有内质网信号的序列蛋白，ubiquilin 4由疏水结构域通过疏水作用连接这些蛋白，并将其连接于内质网。UBL连接19S蛋白酶体的S5a亚基，UBA结合多泛素化的底物蛋白，并开始进行蛋白酶体降解，ubiquilin 4在蛋白的泛素化降解方面具有重要的作用[12,14-15]。为进一步研究ubiquilin 4在细胞内的生物学功能，阐明ubiquilin 4在肿瘤发生、发展过程中发挥的作用，本研究将ubiquilin 4在原核细胞中进行表达，通过谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）标签进行纯化，并在MKN45细胞中通过免疫共沉淀法及蛋白质谱鉴定法寻找与ubiquilin 4相互作用的蛋白，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

DMEM/高糖培养液、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）均购自美国HyClone公司；转染试剂HPXtreme购自瑞士Roche公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、考马斯亮蓝G250、硫酸铵、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，ⅠPTG）和 4,6-联脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPⅠ）均购自美国 Sigma公司；谷胱甘肽琼脂糖凝胶、二氧化碳恒温培养箱均购自美国ThermoFisher公司；正置荧光显微镜购自德国Leica公司；抗泛醌蛋白4（anti-ubiquilin 4，克隆号为A333）鼠抗人抗体购自美国Santa Cruz公司；标签抗体MYC和FLAG购自美国Sigma公司；Alexa Fluor 594荧光标记山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/高糖培养基中，加入100 μg/ml的青链霉素混合液（双抗）。于含5%CO2、37℃的培养箱中进行培养，每隔24～48 h更换培养基，并观察细胞状态。

1.3 细胞转染

转染前1天，将细胞接种至6孔板中，调整细胞密度至转染时的80%～90%。经15～20 h后细胞贴壁牢固，为细胞更换新鲜的全血清培养基。待转染的质粒混匀后，将2 μg质粒加入200 μl的无血清培养基中，混匀。再将混匀的4 μl HP-Xtreme转染试剂加入上述体系，混匀后，室温静置15 min后逐滴加入6孔板中，培养24 h后更换新鲜培养基。

1.4 细胞免疫荧光染色

细胞爬片生长至30%～70%的密度，弃去培养液，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，2%～4%的甲醛室温固定细胞15 min，PBS洗涤，0.5%的Triton X-100通透细胞15 min，PBS洗涤。1%的BSA室温封闭30 min。Anti-ubiquilin 4一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤。加入封闭液稀释好的二抗，室温避光孵育1 h，PBS洗涤。加入DAPⅠ染液，室温避光孵育15 min，PBS洗涤。70%的甘油（采用PBS配制）封片，于荧光显微镜下观察。

1.5 感受态细胞转化

10 ng质粒加入100 μl感受态中，轻弹管壁混匀，放于冰上15～30 min。于42℃的水浴中准确热激90 s，然后迅速放置冰上。5 min后，向管中加入等体积的无抗生素的液体LB（luria-bertani）培养基，室温37℃下220 r/min振荡培养1 h，3000 r/min离心5 min，去掉培养基，菌体全部涂布于加了相应抗生素的LB平板中。

1.6 GST-pull down实验

将转化后的BL21菌液摇到光密度（optical density，OD）600为0.6后，加入终浓度为0.2 mmol/L的ⅠPTG，30℃下诱导6 h，超声破碎后加入Glutathione Agarose纯化。纯化的GST融合蛋白GST-ubiquilin 4与MKN45细胞裂解液于4℃下孵育过夜，各个样本中加入1.5×蛋白上样缓冲液30 μl，沸水煮浴蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.7 考马斯亮蓝染色

SDS-PAGE胶经40%甲醇与10%乙酸固定30min，去离子水洗涤15 min，共洗涤4次；0.12%考马斯亮蓝、10%亚硫酸氨、10%磷酸和20%甲醇染色6 h，去离子水过夜脱色至背景清楚。

1.8 蛋白质谱鉴定

蛋白质谱鉴定及肽段分析由清华大学蛋白质研究技术中心完成。

1.9 免疫共沉淀

MYC-MYH9和FLAG-UBQLN4共转染HEK293T细胞，转染后48 h收集细胞，加入细胞裂解液CF0.15（羟乙基哌嗪乙硫磺酸30 mmol/L、氯化钠150 mmol/L，氯化镁1.5 mmol/L、氯化钾10 mmol/L、0.5%乙基苯基聚乙二醇、二硫苏糖醇1 mmol/L、苯甲基磺酰氟0.5 mmol/L、1×蛋白酶抑制剂混合物）裂解30 min，13 000 r/min离心10 min，吸取上清，加入Anti-FLAG M2 Beads于4℃下孵育3 h，CF0.15洗涤4次后加入2×蛋白上样缓冲液，进行Western blot检测。

2 结果

2.1 外源性及内源性ubiquilin 4蛋白定位

转染后，外源ubiquilin 4在细胞核和细胞质均有分布（图1A）。采用Anti-ubiquilin 4特异性抗体及Alexa Fluor 594荧光标记羊抗小鼠二抗进行内源性ubiquilin 4定位检测，细胞免疫荧光染色结果显示，红色荧光信号检测的内源性ubiquilin 4主要定位于细胞核和细胞质（图1B），这与外源性ubiquilin 4的表达结果一致。

图1 细胞内ubiquilin 4蛋白定位

2.2 ubiquilin 4蛋白的原核表达

将原核表达质粒pGEX和pGEX-UBQLN4分别转化BL21菌株感受态细胞，通过不同的ⅠPTG浓度诱导其表达，并在不同的诱导时间点收集菌液。经考马斯亮蓝染色，在ⅠPTG的浓度为0.1～0.6 mmol/L时均能够得到与预计相对分子质量大小相一致的条带，并且相对表达量随着时间的延长而增加，表明pGEX-UBQLN4在大肠杆菌中成功表达（图2）。不同浓度ⅠPTG诱导表达收集的菌液裂解后，将菌液裂解后的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色，表达的GST蛋白为可溶性蛋白，主要分布于上清中，而GST-ubiquilin 4在上清和沉淀内均有分布，表明GST-ubiquilin 4既可存在于包涵体中，也可溶于菌液上清中。

图2 可溶性ubiquilin 4蛋白原核表达条件优化

2.3 ubiquilin 4相互作用蛋白质谱鉴定

GST-pull down结果显示，GST-ubiquilin 4与裂解液对照孵育组对比，可见一条差异条带，并对其进行蛋白质谱鉴定。根据所选条带的相对分子量大小和蛋白质谱鉴定的蛋白得分，本研究选择相对分子量在＞170 kD，并且质谱鉴定分数高于100分的蛋白作为候选蛋白进行统计，其中，MYH9肽段的数量所占百分比为63.96%，MYH10肽段的数量所占百分比为17.12%，MYH11肽段的数量所占百分比为11.71%，MYH14肽段的数量所占百分比为7.21%。（图3，表1）

图3 ubiquilin 4相互作用蛋白鉴定

表1 蛋白质谱鉴定出的ubiquilin 4相互作用蛋白

2.4 免疫共沉淀验证ubiquilin 4相互作用蛋白

将MYC-MYH9与FLAG-UBQLN4质粒共转染HEK298T后提取细胞总蛋白，用FLAG-ubiquilin 4进行免疫共沉淀后进行Western blot法检测。结果显示，转染空白载体pLVX、单独转染MYC-MYH9和FLAG-UBQLN4的泳道均未能够检测到MYCMYH9条带，而同时转染MYC-MYH9和FLAGUBQLN4对FLAG-ubiquilin 4进行免疫共沉淀则可以检测到MYC-MYH9蛋白条带（图4）。

图4 免疫共沉淀法验证ubiquilin 4与MYH 9的相互作用

3 讨论

已有研究表明，泛素-蛋白酶体降解途径在肿瘤的发病过程中发挥着重要的作用。某些与泛素结合的癌基因蛋白（如N-myc、c-myc等）在蛋白酶体降解时受到阻碍，不能及时地从细胞内清除，从而诱导细胞发生癌变。此外，一些抑癌基因的不稳定也已证实与泛素化降解有关，例如，抑癌基因蛋白p53在某些肿瘤中经泛素化降解后作用增强，导致细胞基因异常扩增，从而引发肿瘤[16-17]。UBQLN4属于泛素类蛋白家族，目前已有研究报道ubiquilin 4在蛋白的泛素化降解方面具有重要的作用[12,14-15]。

本研究将ubiquilin 4在原核细胞中进行表达，采用标签纯化方式筛选出与ubiquilin 4发生相互作用的蛋白，并在MKN45细胞中通过免疫共沉淀法和蛋白质质谱方法进行鉴定，结果显示，MYH9是与ubiquilin 4发生相互作用的蛋白。

MYH9是细胞骨架的组成部分，属于Ⅱ型肌球蛋白。其激活后可在细胞内装配成肌球蛋白丝，通过头部的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶水解ATP产生能量，促进肌丝移动引发收缩力，从而介导细胞的分裂、迁移等过程[18]。近年来，关于MYH9在肿瘤发生、发展过程中的作用越来越受到关注。迁移与侵袭是肿瘤发生转移的重要原因，并且肿瘤上皮细胞的间充质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）也是肿瘤发生远处转移的重要机制，这些均与MYH9影响细胞的黏附延展、趋化及运动等功能有关[18-19]。刘军等[20]通过免疫组织化学染色法及逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测发现，MYH9在骨肉瘤组织中的表达水平高于骨肉瘤癌旁组织（59.6%vs26.9%，P＜0.05），并且使用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）干扰技术将骨肉瘤细胞中MYH9的表达沉默，通过Western blot法检测EMT相关蛋白，结果显示，上皮细胞标志物E-cadherin蛋白的表达增加，间质细胞标志物Vimentin蛋白的表达减少，提示MYH9沉默抑制了骨肉瘤细胞的EMT，表明MYH9在骨肉瘤细胞的转移中发挥着重要的作用。Derycke等[21]研究也显示MYH9可以通过抑制E-cadherin和Catenin复合体的形成，诱导乳腺癌细胞发生EMT，因此，MYH9在乳腺癌细胞的转移中发挥着重要的作用。郑梦颖等[22]收集60例肝癌患者的肝癌组织及癌旁组织，检测MYH9的表达情况，结果显示MYH9在肝癌组织中的表达水平高于癌旁组织（63.33%vs41.67%，P＜0.05）；Western blot法检测显示MYH9蛋白在人肝癌细胞株SMMC-7721及HepG2中的相对表达量均高于正常人肝细胞株LO2（P＜0.05）；同时还发现MYH9与肝癌患者的肿瘤直径、Edmondson分级、TMN分期及是否门静脉侵犯等均有关，这表明MYH9在肝癌的进展中发挥了一定的作用。此外，MYH9在胃癌、肺癌、肾癌及结肠癌等多种肿瘤中的作用均有相关报道[23-28]。这些研究均表明MYH9在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用。

综上所述，虽然ubiquilin 4在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用，但其参与肿瘤细胞内生物学功能的具体机制尚不清楚，本研究通过标签纯化及蛋白质谱鉴定等方式筛选出与ubiquilin 4相互作用的蛋白，为阐明ubiquilin 4在肿瘤中的发病机制奠定了基础。

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