As2O3联合丹参酮ⅡA对结肠癌细胞影响分子机制的探讨

王秀月 张广润 赵川 曹文艳 梁永娟 楚惠媛 陈彻 王勇

结肠癌是死亡率和发病率逐年升高的恶性肿瘤之一[1]。结肠癌患者发生肝转移的概率高达50%，因此治疗过程存在极大的困难[2，3]。有研究表明三氧化二砷（As2O3）对实体肿瘤有抑癌作用[4，5]。研究发现可以通过化疗药物与中药联用减少药物毒副作用，并能发挥药物最佳疗效[6]。TanⅡA是中药丹参中有效的脂溶性成分，具有抗肿瘤作用，可增强5-氟脲嘧啶（5-Fu）对人结肠癌的抗肿瘤作用[7，8]。目前关于TanⅡA联合As2O3对结肠癌作用的研究很少。课题前期研究发现As2O3联合TanⅡA明显抑制结肠癌SW620细胞侵袭转移[9]，本研究进一步探讨As2O3联合TanⅡA对人结肠癌SW620细胞的作用机制，以期为抗结肠癌侵袭转移提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株 人结肠癌SW620 细胞购自上海中科院细胞库。

1.2 主要试剂及药物 Leibovitz's L-15细胞培养基：GIBCO产品；胰蛋白酶（Trypsin）、胎牛血清：HyClone产品；PBS、青链霉素混合液、MTT试剂：北京索莱宝科技有限公司；TRIzol：美国Ambion公司；反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒：美国Promega公司；引物：宝生物（大连）有限公司；5-Fu：上海旭东海普药业有限公司；TanⅡA：上海第一生化药业有限公司；As2O3：湖南省水口山矿务局衡阳实业总公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 选用10%胎牛血清和100U/ml青链霉素混合液的Leibovitz's L-15细胞培养液培养细胞，于37℃和5%CO2且饱和湿度的细胞培养箱内，约2～3天传代或换液1次。

1.3.2 细胞处理 实验分为空白对照组、As2O3单药组、TanⅡA单药组、As2O3联合TanⅡA用药组、5-Fu干预组。空白对照组：不用任何药物治疗。As2O3组：用2.5μg/ml的As2O3处理。TanⅡA组：用10μg/ml TanⅡA处理。As2O3+TanⅡA组：用As2O3（2.5μg/ml）和 TanⅡA（10μg/ml）处理。5-Fu组：用1 000μg/ml 5-Fu处理。

1.3.3 实时荧光定量PCR法检测 SW620细胞中MMP9、VEGF、CD44v6、nm23-H1基因的表达 取对数生长期的SW620细胞，接种于培养瓶中，待细胞贴壁后，按实验分组要求进行药物干预。培养72h后收集各组细胞，用TRIzol提取细胞总RNA，并用Q5000微量紫外分光光度计测量RNA的浓度与纯度，要求 D260/D280为1.8～2.2。取总RNA 5μg，应用反转录试剂盒（反应体系 20μl）合成cDNA。以 cDNA 为模板，按说明书要求对各组细胞的MMP9、VEGF、CD44v6及nm23-H1基因（β-actin为内参照）进行荧光定量 PCR 扩增（PCR引物序列见表1）。反应条件为：95℃ 2min；95℃ 15s；60℃30s；72℃ 30s，共 40个循环。2-ΔΔCt法计算各基因mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。实验结果以均数±标准差（±s）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组内数据两两比较，采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

表1 RT-PCR引物序列

2 结果

各组药物作用后 SW620细胞中 MMP9、VEGF、CD44v6和nm23-H1 mRNA的表达水平差异均有统计学意义（F=20.249；F=8.872；F=36.142；F=47.923，P<0.01）。与空白对照组相比，各用药组MMP9、VEGF、CD44v6的 表达 量 显 著 降 低（P<0.01），nm23-H1 mRNA的表达量明显增高（P<0.01）；As2O3与TanⅡA联合用药组的MMP9、VEGF、CD44v6表达量明显低于各单药组（P<0.05），nm23-H1表达量与各单药组相比，明显上调（P<0.05）。各种药物作用后SW620细胞中MMP9、VEGF、CD44v6及nm23-H1mRNA表达的RT-PCR检测结果见图1、2。

图1 各组SW620细胞中MMP9、VEGFmRNA的表达

图2 各组SW620细胞中CD44v6和nm23-H1mRNA的表达

3 讨论

已有研究表明，As2O3和TanⅡA分别在结肠癌的治疗过程中具有抑制结肠癌细胞转移和侵袭的作用，然而课题前期研究证明两者联合应用能明显抑制结肠癌细胞侵袭转移。恶性肿瘤的发生发展是一个复杂的生物学过程，主要与肿瘤转移基因与肿瘤转移抑制基因的表达失衡、细胞外基质降解、细胞黏附、肿瘤血管生成、肿瘤微环境的改变等因素有关。nm23-H1基因是侵袭与转移相关基因，有研究表明其在高侵袭性的结肠癌SW620细胞中几乎不表达，而上调nm23-H1基因的表达则可抑制SW620细胞的侵袭与转移[10]。肿瘤细胞发展过程中，癌细胞必须先突破细胞外基质，向周围生长，最终实现正常组织的侵袭及转移。大量研究证实细胞外的金属基质蛋白酶MMPs能调节肿瘤发展过程。MMP家族能够调节肿瘤微环境的改变，具有降解细胞外基质的作用，其活化被认为是肿瘤细胞突破基膜以及降解细胞外基质的关键环节[11]。其中MMP2和MMP9被认为是目前发现的唯一可降解细胞外基质基本骨架Ⅳ型胶原蛋白的两种水解酶，它们通过降解细胞外基质，从而促进癌细胞突破细胞外基质和基膜，为肿瘤的侵袭与转移提供必要基础。此外，大量研究发现CD44v6可作为黏附分子与 HA（hyaluronic acid， HA）交联，改变细胞骨架的构象和分布，调节细胞的黏附和运动[12]，并在此基础上募集MMPs，为肿瘤细胞的转移和侵袭提供稳定的微环境。肿瘤侵袭和转移的另一个特征是新生血管的生成，VEGF是最重要的血管生长调节因子之一，可促进肿瘤血管的形成，为肿瘤细胞提供营养物质，肿瘤的高度血管化可促进肿瘤细胞进入血液循环系统，从而向远处进行转移和扩散[13]。因此，VEGF是阻断肿瘤侵袭、转移的重要靶点之一。本研究对两药联合抗结肠癌细胞侵袭转移作用机制做初步探讨，应用实时荧光定量PCR检测与侵袭转移密切相关的MMP9、VEGF、CD44v6、nm23-H1基因。

前期实验证明体外As2O3联合TanⅡA用药对SW620细胞的增殖具有协同抑制作用，还提示联合用药具有减毒并且显著提高治疗效果的双重作用，为临床结肠癌治疗提供了联合治疗方案思路。因此As2O3联合TanⅡA应用于结肠癌的治疗可能是相对比较安全的用药方案，本研究为探索结肠癌治疗的分子机制提供了实验理论依据。但是As2O3联合TanⅡA抑制结肠癌细胞增殖的具体作用机制有待于进一步研究，体外实验结果仍需要通过进一步体内实验研究证明。

本研究采用实时荧光定量PCR实验检测SW620中 MMP9、VEGF、CD44v6、nm23-H1的mRNA表达，结果表明As2O3联合TanⅡA对MMP9、VEGF、CD44v6基因具有明显的抑制作用，对nm23-H1基因具有明显的促进作用。因此，本研究在分子水平上预示了As2O3联合TanⅡA能够抑制结肠癌SW620细胞的侵袭和转移。

综上所述，As2O3联合TanⅡA的抗结肠癌侵袭转移作用与下调 MMP9、VEGF、CD44v6 ，上调nm23-H1的表达密切相关，抗肿瘤的复杂调控机制还需要深入研究。

1 Purushotham AD，Lewison G，Sullivan R.The state of researchand development in global cancer surgery[J].Ann Surg，2012，255（3）：427-432

2 陈冲，闫智勇.结肠癌肝转移动物模型研究进展[J].现代中西医结合杂志，2012，21（1）：98-100

3 Zhang Q，Sha S，Xu B，et al.Prevalence of colorectal cancer in patients with ulcerative colitis：a retrospective，monocenter study in China[J].J Cancer Res Ther，2015，11（4）：899-903

4 Yi Y.Arsenic trioxide inhibits osteosarcoma cell invasiveness via MAPK signaling pathway[J].Cancer Biology & Therapy，2010，10（3）：251-257

5 Wang L， Hu X，Xu Y，et al.Arsenic trioxide inhibits lung metastasis of mouse colon cancer via reducing the infiltration of regulatory T cells[J].Tumour Biol，2016，37（11）：15165-15173

6 Chen YZ， Li ZD， Gao F， et al.Effects of combined Chinese drugs and chemotherapy in treating advanced non-small cell lung cancer[J].Chinese Journal of Integrative Medicine，2010，15（6）：415-419

7 Su CC.Tanshinone ⅡA potentiates the efficacy of 5-FU in Colo205 colon cancer cells in vivo through downregulation of P-gp and LC3-Ⅱ [J].Exp Ther Med，2012，3（3）：555-559

8 樊善继.丹参酮ⅡA对SW480细胞增殖与凋亡的影响[D].南华大学，2014

9 王勇，王秀月，梁永娟，等.As2O3联合丹参酮ⅡA对SW620细胞侵袭转移能力的影响 [J].中国医学创新，2017，14（28）：26-29

10 Qu L，Liang L，Su J，et al.Inhibitory effect of upregulated DR-nm23 expression on invasion and metastasis in colorectal cancer[J].Eur J Cancer Prev，2013，22（6）：512-522

11 Jiang Y， Goldberg ID， Shi YE.Complex roles of tissue inhibitors of metalloproteinases in cancer[J].Oncogene，2002，21（14）：2245-2252

12 Lokeshwar VB， Fregien N， Bourguignon LY.Ankyrin-binding domain of CD44（GP85） is required for the expression of hyaluronic acid-mediated adhesion function[J].Cell Biol，1994，126（4）：1099-1109 13 伊日贵.肿瘤侵袭转移机制研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志，2014，28（10）：937-939