松弛素对马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞MMP-9/TIMP-1 表达的影响

钱盈盈 杨 秀 谢祥成 钱红萍 章 炜

马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy，AAN）是摄入含有马兜铃酸类成分中草药（如关木通、广防己、青木香等）导致的肾小管间质疾病，曾被称为中草药肾病[1]。马兜铃酸（AA-I）是中草药肾病和巴尔干地区特有肾病的主要致病原因[2-3]，迄今为止，其治疗策略仍然有限[4]。松弛素（relaxin，RLX）是松弛素/胰岛素肽激素家族成员，具有较强的抗纤维化作用[5]，本实验拟通过观察RLX 对AA-I 刺激的肾小管上皮细胞（HK-2 细胞）表达细胞外基质、细胞基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）和金属蛋白酶组织抑制因子1 （tissue inhibitor metallopro-teinase-1，TIMP-1）的影响，探讨RLX 在AAN 中抗纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材 料 人肾小管近端上皮细胞系购自中国科学院细胞库。重组人松弛素购自美国Peprotech（批号130-15）；人纤连蛋白（fibronection，FN）ELISA 试剂盒购自武汉博士德（批号EK0349）、人Ⅳ型胶原（human collagen type Ⅳ，Col-Ⅳ）ELISA 试剂盒购自武汉Cusabio（批号CSB-E17116h）；PVDF 膜购自美国Millipore 公司（批号ISEQ00010）；抗体MMP-9/TIMP-1/ACTIN 购自中国Proteintech（批号分别为27306-1-AP，16644-1-AP，60008-1-Ig）；AA-I 购自美国sigma（批号313-67-7）。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养、刺激、分组 HK-2 细胞于DMEM/F12（Gibco，美国，批号11320033）培养基中培养，添加10%胎牛血清，37℃、5%CO2条件下培养。根据刺激方法不同随机分为：对照组（无干预）、AA-I 组（10μg/mL AA-I 刺激48h）、RLX 组（RLX 10ng/mL 干预48h）、RLX+AA-I 组（RLX 10ng/mL 干预48h 后再加AA-I 10μg/mL 刺激48h）。刺激条件参考文献[6-7]。

1.2.2 ELISA 法检测HK-2 细胞外基质分泌情况取对照组、AA-I 组、RLX+AA-I 组HK-2 细胞上清液，依照试剂盒说明测定Col-Ⅳ、FN 浓度。每份标本均设3 个复孔，酶标仪在450nm 处测吸光值，以其均值代表实验数值。

1.2.3 蛋白质印迹分析 对照组、AA-I 组、RLX 组、RLX+AA-I 组HK-2 细胞经胰蛋白酶消化并离心后，以RIPA 裂解缓冲液裂解细胞。经煮沸变性、8% w/v SDS-PAGE 凝胶中电泳后转移到PVDF 膜，在室温下用5%脱脂牛奶封闭1h。膜在TBS-T 中洗涤三次，然后与抗MMP-9、TIMP-1、ACTIN 抗体在4℃下孵育过夜。洗涤3 次，与辣根过氧化物酶标记的相应二抗常温下孵育2h。再次以TBST 清洗膜后用增强的化学发光（ECL）检测试剂盒检测。灰度值强度由TINA 图像软件（Raytest，德国）测定。

1.2.4 统计学方法 应用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（） 表示，两组间比较采用独立样本t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞外基质FN、Col-Ⅳ水平比较 与对照组比较，AA-I 组FN、Col-Ⅳ水平显著升高（P＜0.05），RLX+AA-I 组FN、Col-Ⅳ水平明显低于AA-I 组（P＜0.05），见表1。

表1 各组细胞外基质FN、Col-Ⅳ水平比较（ng/mL，）

表1 各组细胞外基质FN、Col-Ⅳ水平比较（ng/mL，）

注：对照组无任何刺激；AA-I 组予10μg/mL AA-I 刺激48h；RLX+AA-I 组：RLX 10ng/mL 干预48h 后再加AA-I 10μg/mL 刺激48h；FN为纤连蛋白；Col-Ⅳ为Ⅳ型胶原蛋白；AA-I 为马兜铃酸；RLX 为松弛素；与对照组比较，aP＜0.05；与AA-I 组比较，bP＜0.05

2.2 各组MMP-9、TIMP-1 蛋白表达比较 与对照组比较，AA-I 组MMP-9 表达降低，TIMP-1 表达显著升高（P＜0.05）；与AA-I 组比较，RLX+AA-I 组MMP-9 蛋白表达显著升高，TIMP-1 蛋白表达显著下降（P＜0.05）。见图1、表2。

3 讨论

图1 蛋白质印迹分析HK-2 细胞MMP-9、TIMP-1 蛋白表达

表2 各组MMP-9、TIMP-1 蛋白表达比较（）

表2 各组MMP-9、TIMP-1 蛋白表达比较（）

注：对照组无任何刺激；AA-I 组予10μg/mL AA-I 刺激48h；RLX+AA-I 组予RLX 10ng/mL 干预48h 后再加AA-I 10μg/mL 刺激48h；MMP-9 为细胞基质金属蛋白酶9；TIMP-1 为金属蛋白酶组织抑制因子1；AA-I 为马兜铃酸；RLX 为松弛素；与对照组比较，aP＜0.05；与AA-I 组比较，bP＜0.05

AAN 的主要病理特征是广泛的小管间质纤维化，伴有近端小管萎缩和丧失，偶有少量散在或小灶状淋巴及单核细胞浸润，肾小球无明显病变或呈缺血性基底膜皱缩及硬化[8]。HK-2 细胞有机阳离子转运体选择性摄取AA-I，因此，近端管状上皮细胞是AA-I 的易损伤部位[9]。AA-I 反复作用于肾小管上皮细胞，可诱导释放转化生长因子（transforming growth factor beta，TGF-β）等促纤维因子表达上调，导致肾间质纤维化[10]。此外，AA-I 可诱导HK-2 细胞转分化，转分化后的HK-2 细胞直接分泌细胞外基质，促进肾间质纤维化，细胞外基质的增加在AA-I 的进程中起到非常重要的作用[11]。本研究显示，AA-I 可显著增加HK-2 细胞分泌细胞外基质FN 和Col-Ⅳ水平（P＜0.05）。

细胞外基质的过度蓄积是肾间质纤维化的主要病理基础，MMP-9 及TIMP-1 在细胞外基质的降解与重塑过程中发挥了重要作用[12]。细胞基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类锌依赖肽链内切酶系，几乎能降解全部细胞外基质成分[12]。TIMP-1 能特异性地抑制MMPs 的活性，通过不可逆结合抑制MMP-9 活性，从而抑制其对细胞外基质的降解，两者的平衡共同维持着细胞外基质和内环境的稳定[13]。MMP-9 酶活性受到抑制可导致细胞外基质过度沉积，从而导致肾纤维化[12]。本研究显示，HK-2 细胞经AA-I 处理后伴随着细胞外基质水平的升高，细胞表达MMP-9 蛋白减少（P＜0.05），表达TIMP-1 蛋白增多（P＜0.05），提示MMP-9/TIMP-1 蛋白的失衡可能参与HK-2 细胞分泌细胞外基质。

RLX 与胰岛素结构相似，通过与RLX 家族肽受体（RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4）受体结合，可以发挥多种生物效应；RLX 因其在妊娠期间发挥多种生理效应包括子宫收缩、诱导宫颈生长和变软、结缔组织重构等为分娩做准备而被广泛认识[14]。近年来，随着对RLX 的广泛深入研究，其在非生殖领域中的作用引起研究者们的极大兴趣。RLX 的主要代谢作用在于其可以通过抑制胶原合成、激活MMPs、抑制TIMPs 导致结缔组织重塑，并被证明是有效的抗纤维化药物[15-18]。本研究发现，RLX 可以诱导HK-2 细胞MMP-9 表达升高，抑制TIMP-1 的表达，并逆转AA-I 诱导的细胞外基质异常积累（P＜0.05），认为RLX 可能通过调节MMP-9/TIMP-1 的平衡状态改善AA-I 所致肾脏纤维化。

综上所述，本实验研究显示，RLX 可上调MMP-9 蛋白表达和下调TIMP-1 蛋白表达，减少细胞外基质的沉积，从而抑制肾小管间质纤维化，可能对AAN起到保护作用。