转谷氨酰胺酶改性蛋白质的研究进展

□ 石天臣 黄 学 王学锋 宁夏夏进乳业集团股份有限公司

蛋白质是食物的重要成分之一，不仅是人体重要的营养物质，其功能特性对于食品的品质和组织结构具有重要的作用。采用物理、化学、酶法改性蛋白质对完善功能性蛋白质有重要意义。TG是一种广泛存在于动植物组织中的天然酶制剂，许多食品中都含有天然的TG[1]。TG通过在赖氨酸上ε-氨基和谷氨酸上γ-羟酰胺基之间催化酰基转移反应，使蛋白质发生分子间和分子内共价交联。蛋白质分子的这种变化有利于形成强有力凝胶，改善各种蛋白制品的弹性、黏和性、保水性等品质。

TG在不改变食物pH值、颜色、味道或营养的前提下对蛋白质进行改性。改性反应形成的L-G键（Glu-Lys）在人体内能被消化吸收，因此TG改性处理不会降低蛋白的营养价值。而且酶的交联作用将赖氨酰甲硫氨酸二肽或赖氨酰精氨酸二肽结合到酪蛋白上，弥补蛋白中甲硫氨酸和精氨酸的不足，改善蛋白质的营养价值[2]。

1 转谷氨酰胺酶催化反应机制

动物来源的TG成本极高，目前在食品领域中应用的TG主要是微生物来源的（Microorganism Transglutaminase，MTG）。TG通过胺的导入、交联、脱胺三种途径改变蛋白质性质。具体反应机制如图1所示：TG催化蛋白质及肽键中谷氨酰胺残基γ-羰基和伯胺之间的酰基转移反应如图1中的（a）所示，利用该反应可将赖氨酸引入蛋白质以改善营养；当蛋白质中赖氨酸残基γ- 氨基作为酰基受体时，蛋白质在分子之内或分子之间形成ε-（γ-谷氨酰）赖氨酸共价键如图1中的（b）所示，蛋白质分子发生交联[3]，食品发生质构变化，从而赋予产品特有质构特性和黏合性能；当不存在伯胺时，水会成为酰基受体，谷氨酰胺残基脱去胺基，如图1中的（c），该反应可用于改变蛋白质等电点及溶解性。

图1 转谷氨酰胺酶催化机理

TG催化蛋白质形成聚合物的交联程度与底物蛋白的构象有关，并不是所有包含有Glu和Lys残基的蛋白质分子间都可以形成交联聚合物。底物蛋白质的热力学相合性（Thermodynamic consistency） 影响其交联反应。热力学不相同则使蛋白不能在酶催化部位相互重叠，两两之间不能反应，例如亲水蛋白和疏水蛋白相斥也就引起热力学不相合[4]。另外，蛋白质结构构象和Lys、Glu残基部位也影响异源聚合物的形成。转谷氨酰胺酶作用底物选择性见表1。

近年来，一些科学家的研究也与表1基本吻合。2001 年，唐传核等人用微生物转谷氨酰胺酶分别催化酪蛋白酸钠和乳清蛋白，结果表明，酪蛋白中的а-酪蛋白、β-酪蛋白易被催化，而κ-酪蛋白不易被催化，乳清蛋白的β-乳球蛋白、а-乳白蛋白都能被催化，而β-乳球蛋白更易受 MTG的催化[5]。对乳清蛋白进行加热预处理，同时添加还原剂可明显提高 MTG 对乳清蛋白的催化活性。2002 年 Han 等报道在预热情况下酪蛋白和乳清蛋白之间可以聚合，而 2002 年唐传核等人研究 TG催化异源蛋白聚合机理，认为酪蛋白和乳清蛋白不能聚合[6]；而大豆蛋白和乳清蛋白可以聚合，可见二者之间存在一定的矛盾。对于大豆蛋白和酪蛋白之间能否聚合，至今还未有确凿的证据证实。

目前，研究者普遍认可转谷氨酰胺酶改性蛋白质的主要机制就是形成了异构肽键。Sabine Lauber等人得出经TG改性的脱脂乳蛋白形成的异构肽键基本全部是分子间异构肽键，因此即使少量的酪蛋白交联也会显著地改变乳蛋白的各种功能性质。Norbert Raak等人提出异构肽键的含量和聚合度是酸酪蛋白凝胶增强的驱动器。文章中将酪蛋白进行不同时间（1、2、3、8、20、24h）的TG酶处理，并以未加酶的酪蛋白为对照组，分别测定不同时间酶处理的酪蛋白的聚合度（polymerisation degree）和异构肽键(isopeptide bonds)，并建立聚合度和异构肽键与酸凝胶强度的函数关系图。从中得出在TG改性酪蛋白温度和TG浓度一定时，聚合度只与酶改性时间有关，并且随着聚合度的增加凝胶强度也逐渐增加。在聚合度达到85%（酶改性3h）时酸凝胶强度达到最大，继续增加酶改性时间（聚合度增大），酸凝胶强度反而减小。异构肽键在达到0.08 g /100 g的过程中呈线性增加，达到0.146 g/ 100 g时酸凝胶强度达到最大（295Pa）。Norbert Raak等人进一步得出在相同的异构肽键含量情况下，聚合物的大小也影响着酸凝胶强度，并且酪蛋白在含有较少的二聚物而较多的多聚物时形成的酸凝胶性更好。

表1 转谷氨酰胺酶作用底物选择性表

2 转谷氨酰胺酶改性作用对蛋白质功能性的影响

2.1 溶解性

蛋白质溶解度由与水接触的蛋白质表面亲水性基团和疏水性基团的比例决定。一般来说，蛋白质分子表面上的疏水性基团越少，溶解度越高。同时，蛋白质的自身结构和溶液中的pH值、离子强度以及温度等都是影响蛋白质溶解性的重要因素。而蛋白质的溶解度影响蛋白质功能特性，特别是乳化性、起泡性和凝胶性[7]。

Agyare等人用MTG对热处理过的乳清分离蛋白分散液进行改性。结果发现在pH值为4.0和5.0时，MTG改性后的乳清蛋白分散液溶解度降低。原因是酶改性反应提高了β-乳球蛋白的热稳定性，促进其聚合，聚合反应生成的G-L键改变了蛋白表面基团的疏水/亲水比率，造成在等电点pH值附近的大量沉淀。蛋白质这种表面基团的疏水/亲水比率变化，会直接影响产品的弹性、黏着性及咀嚼性等表观性质。蛋白质溶解度则直接影响凝胶性、乳化性、黏度、起泡性和持水力等功能特性[8]。

Hong等人发表了用MTG在不同pH条件下处理猪肉肌原纤维蛋白增加蛋白质溶解度的研究。研究发现，在低离子强度和pH值为3.0时，MTG改性的肌原纤维蛋白的溶解度比未经酶改性的肌原纤维蛋白提升了50%。原因可能是谷氨酰胺残基电离，中和带正电的胺基离子，因此降低了蛋白质的水合作用。

Renzetti等人研究发现，通过MTG催化蛋白质发生脱酰胺反应可以增加蛋白质的溶解性。富含谷氨酰胺和天冬酰胺的蛋白，如大豆蛋白和小麦蛋白，可以通过酶催化反应分别转化为谷氨酸和天门冬氨酸。所得的脱酰胺蛋白表现为较低的等电点，从而增加蛋白质在大多数微酸食品系统中的溶解度。在高浓度的NaCl溶液中含有大量氯离子，氯离子与带正电荷的蛋白质相结合，降低了静电排斥，提高疏水相互作用。这些反应会促使不溶性蛋白质聚集体的形成，降低其溶解度。然而，通过MTG催化增加了蛋白质的净负电荷，这有利于蛋白质聚集体的解离，从而增加溶解度。

2.2 凝胶性

蛋白质的凝胶作用可以得到具有独特物理性质的食物，如酸乳，、奶酪，、豆腐，、鱼糜等。Damodaran称凝胶是介于固态和液态之间的中间状态，通过共价或非共价键的交联，形成能够维持水或其他它低分子量的网络结构，是蛋白质在食品体系中重要的功能特性之一。此外，凝胶的形成和特性取决于蛋白质与蛋白质间相互作用的形式和程度，反过来又受蛋白质种类、浓度、温度、pH、离子强度及其他成分（如乳糖）的影响。稳定的凝胶通常形成在蛋白质的等电点。

经TG催化的酪蛋白凝胶与正常酸凝胶和凝乳酶形成的酪蛋白凝胶相比，其凝胶形成速度快并伴随较高的黏粘弹性模量。与热处理相比，TG的交联作用可以促进较低含量，甚至不能成胶的蛋白质形成凝胶，并且其凝胶的弹性模量和凝胶强度远远大于相同条件下的热凝胶。Motoki M也证明用MTG催化乳蛋白，通过蛋白质之间的相互交联，能够在相对较低的蛋白质浓度下得到高弹性、不可逆的凝胶。但是Huppertz T发现用TG催化酪蛋白之后在凝乳酶的诱导下絮凝时间却比较长。而且絮凝时间与k-酪蛋白单体残基呈线性相关，也就是说在TG完全交联情况下的絮凝是不存在的。文中进一步证明TG抑制凝乳酶的絮凝主要是在絮凝的第二阶段如酪蛋白絮凝的凝胶强化阶段。TG改性酪蛋白后，凝乳酶诱导形成凝胶的时间还需实验进一步验证。

Ardelean等人向牛奶中加入MTG（3U /g 蛋白质）于40℃处理60min，之后在85 ℃灭酶10min，通过加入40g/L D-葡萄糖酸-δ-内酯模拟微生物产酸，促进凝胶的形成。SDS-PAGE电泳结合相对光密度扫描发现牛奶中31%的蛋白发生交联，并有效改善了凝胶的强度和减少酸凝胶的乳清析出。然而Guo等人发现过量的TG会引起凝胶的强度降低，原因可能是过量的交联产生的大量高分子聚合物会抑制蛋白均匀网络的生成。Sabine Lauber等人向脱脂牛奶中加入10.5U/mLl的MTG于40孵育150min，然后经热处理灭活。这个改性后的酸奶的破碎强度从550CN增加到920CN。Smiddy M A证明了经TG改性的酪蛋白形成的分子间交联使酪蛋白胶束粒子由缔合胶体粒子转变为微凝胶粒子。经TG改性的酪蛋白胶束稳定性更好，增强了酪蛋白胶束对分散剂、热处理、酸和酒精等的稳定性。

Herrero等人将新鲜猪肉制成肉糜，分别添加0%、0.05%、0.1%的MTG，在4℃，20kPa反应72h。结果发现，通过MTG催化引入的交联极大地改变了肌球蛋白重链的结构，改进了蛋白质的硬度，、弹性，、结合力和黏粘合性，从而导致凝胶具有紧密和有序的蛋白质网络结构。通过拉曼光谱分析得出，其中，α-螺旋结构大幅减少，β-折叠与β-转角结构大幅增加。中国南京肉食质量与安全控制中心研究TG处理肌纤维分离蛋白和大豆分离蛋白时，温度和离子强度对该反应的影响。结果表明，大豆分离蛋白中除了大豆球蛋白外大部分蛋白质在温度大于50℃会被TG交联。在温度由20℃到～90℃的变化过程（每10℃测一个样，共八个样品共8个样品）中，肌动蛋白的SDS-PAGE电泳条带逐渐变浅。说明随着温度的升高，肌动蛋白参与酶改性反应越来越显著。而添加了KCL会阻止电泳条带的变浅，说明肌动蛋白的酶改性反应会被离子抑制。流变性测试也表明，在不考虑酶改性时间的影响下，酶改性显著提高了肌纤维分离蛋白凝胶的弹性，也显著改善了肌纤维分离蛋白和大豆分离蛋白混合物凝胶的凝胶性能。

2.3 持水力

持水力是指蛋白质构成的基体通过物理方式截留大量水而阻止水渗出的能力。蛋白质的持水力对肉制品和面包的感官品质有着重要的影响。

Imm等人在脱脂乳中添加4种梯度（5、10、15、20 U/g蛋白）的TG，在40℃下反应3h，在85℃5min灭酶后冷冻干燥成改性脱脂乳粉。通过对改性脱脂乳粉进行复溶凝胶，结果发现与未经改性的脱脂乳粉相比，改性后的脱脂乳粉的热诱导（90℃，30min）凝胶及GDL诱导的酸凝胶，其凝胶强度和持水力均显著提高。其中，当添加量为10U/g时，凝胶强度和持水力最强。流变测量的结果显示酶改性后的脱脂乳粉形成凝胶的速度更快以及更具有弹性。因此，通过这种方法制备的酸凝胶，提升了凝胶的持水力，表明它可用于低脂肪酸奶的制造，以减少酸奶在生产运输过程中的脱水收缩。

Han等人研究发现肌原纤维蛋白中酶的浓度达到一定程度后，凝胶持水力与酶浓度呈现负相关关系。这是因为酶的浓度升高，蛋白质分子内或分子间的交联增多，使蛋白质与水的结合作用程度降低。所以在实验中应严格控制添加酶的量。

2.4 黏度

黏度是流体黏滞性的一种量度，是流体流动力对其内部摩擦现象的一种表示。它是几个复杂变量之间相互作用的表现，其中粒径、形状、蛋白质和溶剂的相互作用、流体力学体积以及水合态下分子的灵活性都影响黏度。Braun等人研究发现，溶液浓度越高，粒径越大，在溶液中分子的密度就越大，分子之间发生相互作用减少了分子之间的空间，表现出较低的流动性和较高的黏度。

在许多食品中，例如酸奶和冰淇淋，黏度是产品品质的主要标准之一，与乳化性和凝胶性紧密地联系在一起。Gauch等人将全脂乳和乳清蛋白液按不同比例混合后，加入MTG（0.5U/g）于40℃下反应2h，然后80℃ 2 min灭酶。结果发现所有经酶改性的酸奶比对照组表现出更高的表观黏度和稠度。因为交联反应产生大量的高分子聚合物，减少了蛋白质网络中水的流动性，给予产品适当的稠度。根据Bµnisch等人的研究表明，酶的浓度越高，其促进产生的交联程度越高，样品的聚合程度和黏度越大。在用MTG处理αs-酪蛋白和β-酪蛋白的蛋白膜实验中发现，表面黏度比对照组增加了近100倍，其中β-酪蛋白膜增加的更快。这与Rodriguez-Nogales的研究结果是一致的，原因是β-酪蛋白含有大量非均匀排列的疏水基和亲水基，使其具有典型的表面活性剂特性，尤其是在油/水乳状液界面吸附上。

3 结论与展望

本文介绍了TG改性蛋白质的主要机制是通过酰基转移反应，使蛋白质之间形成异构肽键。蛋白质之间相互交联，形成分子量较大的聚合物并改变了蛋白质的疏水性，影响了蛋白质的溶解性，从而改变与溶解性密切相关的凝胶性、黏度和持水力等特性。

蛋白聚合技术已被越来越多地应用于食品工业中，有效地改善特定食品的功能特性。TG则是目前蛋白交联中研究最广泛和深入的一种酶。微生物发酵制造TG的技术也为TG投入市场应用提供了可能性。并且经过TG改性的蛋白质可以被机体所分解吸收，通过动物饲养试验，研究者也发现，大白鼠饲喂经TG处理的酪蛋白与饲喂天然酪蛋白相比较，其增重、蛋白质效率、蛋白质生物价均相同。通过分析大白鼠的尿液和粪便证实有99%的L-G基团被动物吸收。因此TG改性蛋白质的市场前景是很可观的。但目前研究MTG交联蛋白质的机理和改性蛋白质在机体内的消化吸收过程的文章还是比较少，有待进一步研究。