HPLC法测定山葡萄藤中白藜芦醇含量

杨荣艳 刘琬晖 高楠楠

[摘要] 目的 建立采用超声提取，高效液相色谱法（HPLC）测定山葡萄藤中白藜芦醇的含量。方法 采用色谱柱：Inertsil ODS-3 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（40：60）；流速：1.0 mg/mL；柱温：30℃；检测波长：306 nm； 进样量：10 μL。结果 白藜芦醇在0.504～75.6 mg/mL范围内呈良好的线性关系。测定10批山葡萄藤中白藜芦醇平均含量为0.48%，平均回收率95.16% （RSD=1.94%，n=9）。结论 该实验采用超声提取，并对提取条件进行探讨，得出最佳条件为超声时间45 min、超声功率300 W、固液比1∶250（g/mL）、溶剂为甲醇。该研究表明该方法简便、快速、经济、可靠，专属性强，可用于山葡萄藤的质量控制。

[关键词] 山葡萄藤；高效液相色谱法；白藜芦醇

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2018）05（c）-0006-03

[Abstract] Objective Ultrasonic extraction and high performance liquid chromatography （HPLC） were used to determine the content of resveratrol in grape vines. Methods Chromatography column： inertsil ODS-3 C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）； mobile phase： methanol-0.05% phosphoric acid solution （40：60）； flow rate： 1.0 mL/min； column temperature ： 30°C； detection wavelength： 306 nm； injection volume： 10 μL. Results Resveratrol showed a good linear relationship in the range of 0.504 to 75.6 mg/mL. The average content of resveratrol in 10 batches of vines was 0.48%， and the average recovery was 95.16%（RSD=1.94%，n=9）. Conclusion Ultrasonic extraction was used in this experiment and the extraction conditions were investigated. The optimal conditions were： ultrasonic time 45 min， ultrasonic power 300 W， solid-liquid ratio 1：250（g/mL）， and methanol as the solvent. The study shows that this method is simple， rapid， economical， reliable， and highly specific. It can be used for quality control of vine vines.

[Key words] Mountain vines； High performance liquid chromatography； Resveratrol

山葡萄藤是吉林省食品藥品监督管理局下达制定的地方药材标准，计划文件号为2016009。山葡萄藤为葡萄科植物山葡萄 Vitis L. amurensis Rupr.干燥藤茎。春至秋季采藤茎，晒干。其主产于东北、山西、山东等地[1-2]，山葡萄藤为“消风止痛宁胶囊”中的君药，其味酸、凉，归肾、肝、膀胱经[1]。据文献报道，山葡萄藤主要含有白藜芦醇成分[3]，白藜芦醇是在逆境或遭遇到病原侵害时分泌的一种植保素，具有抗衰老、皮肤保健和抗肿瘤作用[4]。目前白藜芦醇成分在虎杖、山葡萄、山葡萄叶和葡萄籽中研究报道比较多[5-9]，尚未发现对山葡萄藤中白藜芦醇成分进行了定量研究。该实验利用HPLC法测定山葡萄藤中白藜芦醇含量，此方法简单环保、准确且重复性好，为山葡萄质量控制和评估提供新的参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪（带DAD检测器）；岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪（带紫外检测器）；电子天平BT125D型（北京赛多利斯仪器有限公司）；超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率300 W，频率40 kHz）；纯水器（德国）。

1.2 试药

山葡萄藤药材10 批，均采自吉林省，并经吉林农业大学中药材学院韩忠明教授鉴定（见表1）；白藜芦醇对照品（批号111535-200301，中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯（天津康科德科技有限公司），磷酸为分析纯（天津光复精细化工研究所）、水为实验室自制的超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Inertsil ODS-3 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（40：60）； 流速： 1.0 mL/min； 柱温：30℃；检测波长： 306 nm；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取白藜芦醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取该品粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。实验过程要避光操作。

2.4 专属性考察

取对照品溶液和供试品溶液，按照上述色谱条件进样分析，色谱图见图1、图2。白藜芦醇的保留时间为22.008 min，且与邻近的色谱峰分离度均大于1.5。

2.5 线性关系考察

取白藜芦醇对照品20.16 mg，置200 mL量瓶中用甲醇溶解并定容至刻度，作为对照品储备液（100.8 μg/mL）。精密吸取对照品储备液0.5、1、5、10、20、50、75 mL分别置100 mL容量瓶中用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得（此溶液浓度分别为0.504、1.008、5.04、10.08、20.16、50.4、75.6 μg/mL）。分别精密吸取10 μL进样，在上述色谱条件下进行HPLC分析，以质量浓度为横坐标（X ），峰面积为纵坐标（Y ），得回归方程Y=78.13X-5.984（r2=0.999 9）。结果表明在此分析条件下，白藜芦醇在0.504～75.6 μg/mL范围内呈良好线性。

2.6 稳定性试验

取S1 样品，按照供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，分别放置0、2.5、5、8、10、16、18、31 h时，按照上述色谱条件，测定白藜芦醇峰面积。结果按峰面积计算，RSD=0.4%。结果表明样品溶液在31 h内基本稳定。

2.7 精密度试验

将白藜芦醇对照品溶液（20.16 μg/mL）按照上述色谱条件连续进样6次，结果峰面积RSD为0.3%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取S1 样品，按供试品溶液制备方法平行制备6 份供试品溶液，按照上述色谱条件实验，山葡萄藤药材中白藜芦醇的含量平均值为0.48%，RSD=1.59%。

2.9 加样回收率试验

精密称取已测定S1 样品9 份各0.2 g，每3 个为一组，每组按照低、中、高分别加入对应含量的对照品溶液，再按照供试品溶液制备过程制备供试品，得到3 组9 个样品溶液，按照之前色谱条件进样测定分析，平均回收率为 95.16%，RSD=1.94%（n=9）。

2.10 含量测定

取10 批山葡萄藤药材0.2 g，精密称定，按供试品溶液制备过程制备供试品溶液，在再按照之前色谱条件对10 批山葡萄藤药材进行含量测定，结果见表2。

3 讨论

3.1 测定波长的选择

据文献报道，白藜芦醇在306 nm波长处有最大吸收[10]。以甲醇-0.05%磷酸溶液（40：60）为流动相，流速为1.0 mL/min，将对照品溶液、供试品溶液分别注入带有DAD检测器的液相色谱仪，结果白藜芦醇对照品在306 nm附近有最大吸收。山葡萄藤样品中在306 nm处也有最大吸收峰，并且紫外光谱与对照品紫外光谱相同。因此，该实验采用306 nm作为测定波长。

3.2 提取方法的考察

取S1样品2份，每份（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇25 mL，称定重量，分别考察：①超声处理（功率300 W，频率40 kHz）45 min，②加热回流45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表明超声处理、加热回流后，样品含量几乎没有差异，从操作简便、节能角度考虑，选择超声处理作为提取方法。

3.3 提取溶剂的考察

取S1样品4份，每份（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、50%甲醇、60%乙醇、70%乙醇各25 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）45 min放冷，再称定重量，用各自的溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果用甲醇做提取溶剂时，样品含量比其他3种提取溶剂高，所以选择用甲醇做提取溶剂。

3.4 超声时间的考察

取S1样品4份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇25 mL，超声处理15、30、45、60 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表明超声处理45、60 min时样品含量较高，二者相差较小，正文选取了超声处理为45 min。

3.5 稀釋体积的考察

取S1样品6份，每份（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，前3份样品分别精密加入甲醇25、50、100 mL，后3份样品做100%加标回收，结果表明稀释体积为精密加入甲醇50、100 mL时，样品含量回收率分别为96.21%、96.23%，二者的回收率相差不大，故正文选取了精密加入甲醇50 mL。

3.6 超声功率的考察

取S1样品3份，每份（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇50 mL，在180、240、300 W 3种功率下超声处理45 min，结果表明超声功率为300 W时样品含量较高，正文选取了超声处理的功率为300 W。

3.7 色谱柱的考察

分别考察了3根不同厂家的色谱柱（Inertsil ODS-3 C18色谱柱、Inertsil ODS-SP C18色谱柱、WondaSil C18-WR色谱柱），结果表明：3个不同品牌的色谱柱，分离效果都很好。

3.8 光照对白藜芦醇的考察

把同一浓度的白藜芦醇对照品溶液分别在避光条件下、光照3 h后注入液相色谱仪测定，检验结果：光照3 h后，白藜芦醇对照品溶液分解为两个峰，白藜芦醇峰面积为避光条件下峰面积的1/6。故正文要求避光操作。

[参考文献]

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[2] 吉林省中医中药研究所，长白山自然保护区管理局，东北师范大学生物系编著.长白山植物药志[M].长春：吉林人民出版社，1982：724.

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[4] 田春芳，张波，刘景磊，等.HPLC法测定离体葡萄叶中茋化物的含量[J].湖北农业科学，2013，52（10）：2411-2413，2419.

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[7] 邢琪昌，卢昊，付晓，等.高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量[J].湖北中医药大学学报，2013，15（3）：33-35.

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[9] 杨莹，管敬喜，谢太理，等.广西主栽葡萄品种果实白藜芦醇及其糖苷HPLC定量分析[J].南方农业学报，2012，43（3）：318-321.

[10] 李晓东，李绍华，闫树堂.葡萄白藜芦醇提取和HPLC定量测定适宜条件的研究[J].园艺学报，2006，33（4）：836-838.

（收稿日期：2018-02-23）