吡格列酮通过下调Toll样受体/核因子-κB信号通路对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

孙 军 温昌明 张保朝 闻公灵 周 静

(南阳市中心医院神经内科，河南 南阳 473003)

缺血性脑血管病的治疗方法主要包括溶栓治疗、降纤药物治疗、抗血小板治疗、抗凝治疗、中药治疗及外科手术治疗等。溶栓治疗是指通过血管再通恢复局部供血，但进行再灌注则会加重缺血组织的进一步损伤〔1〕。局灶性脑缺血再灌注损伤中先天性免疫应答及炎症反应起着重要作用〔2～4〕。Toll样受体(TLR)4在炎症反应中起重要作用，缺血再灌注中，TLR4/核因子(NF)-κB信号转导途径可引起NF-κB转移，NF-κB的活化可进一步诱导白细胞介素(IL)-6、IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性因子的表达，引起炎症反应并加重损伤，诱导神经细胞凋亡〔5，6〕。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ是一种配体激活型核转录因子，属于Ⅱ型核受体超家族，在体内多种生理和病理过程中发挥重要作用〔7〕。近年来研究发现，PPARγ激动剂在多种脏器缺血再灌注损伤动物模型中，能减轻其缺血再灌注病理损伤，说明PPARγ具有抑制炎症反应和炎性因子表达的功能〔8〕。本试验观察吡格列酮对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及对大鼠外周血中IL-6、TNF-α含量及脑组织中TLR4、NF-κB表达的影响，探讨其脑保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 吡格列酮购于连云港德源药业有限责任公司，TLR4、NF-κB抗体购自英国Abcam公司，鼠抗IL-6、TNF-α单克隆抗体、链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂购于武汉博士德公司，辣根酶标记山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G购于中杉金桥，酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购于美国R&D公司，Trizol Trizol、反转录试剂盒(PrimerScriptTM RT reagent Kit)、荧光定量试剂(SYBR Green I)购于日本TaKaRa公司。低温高速离心机购于北京医用离心机厂，Multiskan MK3 型酶标仪购于芬兰 Thermo Labsys2tems公司，荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪购于瑞士Roche公司。

1.2大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型制备 术前12 h禁食，自由饮水，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)大鼠，仰卧固定于手术台上，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，结扎CCA和ECA，在ECA结扎点近端用1 ml注射器针头刺一小口，将选取好的栓线自左ECA 插入CCA分叉处，固定线栓，剪断ECA结扎点近心端。调整方向，将线栓插入左ICA，轻柔推进，长度约为(18±0.5)mm，阻断大脑中动脉，造成局灶性脑缺血。阻断2 h后，拔出栓线，进行再灌注。假手术组仅进行麻醉和血管分离，不导入栓线。造模后将大鼠放入干净的饲养笼中，术中、术后注意保暖，自由采食和饮水。

1.3动物分组及给药 体重250～300 g的雄性健康SD大鼠60只，随机分为假手术组、模型组、生理盐水干预组(造模前3 d及术前1 h灌胃给予生理盐水2 ml)、吡格列酮治疗组〔造模前3 d及术前1 h灌胃给药(吡格列酮片15 mg/kg)〕各15只。

1.4神经功能缺损评分 观察并记录大鼠神经功能缺失症状；0分，无神经病学症状；1分，对侧前爪不能完全伸直；2分，行走时向瘫痪侧旋转；3分，向病灶对侧跌倒；4分，意识丧失，不能自发活动；5分，死亡。取评分在1～3分者纳入研究。

1.5脑梗死体积的测定 每组随机取5只大鼠，用水合氯醛麻醉后快速断头取脑，置于-20℃冰箱中冷冻。以2 mm间距冠状切成5片，将大脑切片浸泡在2%氯化三苯基四氮唑(TTC)缓冲液中，放入37℃烘箱中避光孵育30 min。以4%多聚甲醛固定，脑梗死组织为白色，正常脑组织显示为红色。相机拍照采集图像后用Image J1.37图像分析软件，计算梗死体积百分比(脑梗死体积/对侧脑体积)。

1.6大鼠血清抽取及组织切片制备 4组再灌注24 h后，用水合氯醛麻醉打开胸腔，抽取心脏血2 ml，待常温凝固1 h后，3 000 r/min离心20 min，取上清液，用于ELISA检测。取血之后，剥离脑组织，先用生理盐水100 ml冲洗，然后用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片，用于免疫组化染色。

1.7ELISA测定血清IL-6和TNF-α的浓度 血清IL-6和TNF-α浓度采用双抗体夹心SABC-ELISA法测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行。用酶标仪测定450 nm处测OD值，通过绘制标准曲线求出样品中IL-6、TNF-α浓度。

1.8免疫组化技术检测脑组织TLR4和NF-κB 蛋白的表达 大鼠脑组织按照常规固定、石蜡包埋、切片后，采用SABC法检测TLR4和NF-κB蛋白的表达。按照免疫组织化学试剂盒说明书操作步骤，用3%去离子水过氧化氢孵育10 min清除内源性过氧化物酶；3%牛血清白蛋白(BSA)室温孵育封闭1 h；分别加入TLR4和NF-κB 鼠单克隆抗体(1∶100)4℃过夜，滴加适当比例的辣根酶标记山羊抗小鼠IgG室温孵育1 h，滴加SABC复合物室温反应30 min；DAB显色，酒精脱水，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.9实时荧光定量RT-PCR技术检测脑组织TLR4和NF-κB mRNA的表达 取大鼠再灌注24 h后的脑组织，用Trozol法提取组织总RNA，总RNA质量用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测；采用PrimeScriptTM反转录试剂盒合成cDNA，将反转录产物作5倍稀释用于后续荧光定量PCR分析。 根据NCBI数据库中公布的大鼠TLR4、NF-κB 和β-actin的mRNA序列为模板，按照目的片段横跨两个外显子的原则，用oligo6.0软件设计RT-PCR引物(表1)。所有引物由大连宝生物工程有限公司合成。RT-PCR扩增条件：预变性95℃×5 min，变性95℃×30 s，退火60℃×30 s，延伸72℃×30 s，均为35个循环。用β-actin作为内参，采用2-△△Ct法对数据进行相对定量分析，即基因表达差异=2-△△Ct，△△Ct=实验组(目的基因Ct值-内参基因Ct值)-对照组(目的基因Ct值-内参基因Ct值)。

表1 实时荧光定量RT-PCR引物信息

1.10数据分析 采用SPSS20.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1各组神经功能评分比较 模型组及生理盐水干预组均表现出明显的神经运动功能障碍，术后神经功能评分〔(2.3±0.69)分、(2.5±0.62)分〕显著高于假手术组(0分，P<0.01)，说明造模成功；而吡格列酮治疗组神经功能损伤症状明显改善，术后神经功能评分〔(1.5±0.73)分〕显著低于模型组和生理盐水干预组(P<0.05)。

2.2各组脑梗死体积比比较 假手术组脑组织切片经TTC染色全部呈红色，无梗死灶形成；模型组和生理盐水干预组脑组织染色可见有明显的白色梗死灶，主要位于右侧额叶、顶叶皮质及纹状体；吡格列酮治疗组脑组织梗死灶体积比〔(14.69±0.94)%〕显著低于模型组〔(41.65±1.38)%〕和生理盐水干预组〔(37.21±2.26)%,P<0.05〕。

2.3各组血中 IL-6和TNF-α浓度比较 与假手术组相比，模型组和生理盐水干预组血清 IL-6和TNF-α含量都显著升高(P<0.01)；与生理盐水干预组、模型组相比，吡格列酮治疗组血清IL-6和TNF-α含量都显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清中IL-6和TNF-α浓度比较

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05；与生理盐水治疗组比较：3)P<0.05，下表同

2.4各组脑组织TLR4和NF-κB 蛋白表达免疫阳性细胞数比较 TLR4、NF-κB 免疫组化阳性表达呈棕黄色，阳性细胞染色主要位于胞膜及胞质。假手术组偶见TLR4、NF-κB 免疫阳性细胞，模型组及生理盐水干预组TLR4、NF-κB 免疫阳性细胞显著增加(P<0.01)，吡格列酮治疗组TLR4、NF-κB 免疫阳性细胞明显减少(P<0.05)，见表3及图1。

表3 各组脑组织TLR4、NF-κB 免疫阳性细胞个数比较

图1 各组脑组织TLR4、NF-κB免疫阳性细胞个数(SABC法，×200)

2.5各组脑组织TLR4和NF-κB mRNA表达比较 与假手术组相比，模型组和生理盐水干预组脑组织中TLR4、NF-κB mRNA表达显著上调(P<0.01)，吡格列酮治疗组TLR4、NF-κB mRNA表达与模型组和生理盐水干预组相比显著下调(P<0.05)。见表4。

表4 各组脑组织TLR4、NF-κB mRNA表达比较

3 讨 论

目前研究发现有多种药物如芒果苷〔9〕、葛根素〔10〕、芹菜素〔11〕、熊果酸〔12〕等对脑缺血再灌注损伤都有一定的保护作用，PPARγ激动剂也是在缺血性脑损伤中研究较多的一种药物。已有大量研究证明，PPARγ激动剂WY14643、罗格列酮、吡格列酮等对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，可以抑制炎症反应，减少组织损伤等。邱林等〔13〕研究发现，吡格列酮可以促进缺血再灌注脑组织中PPARγ的表达水平，降低脑组织炎性因子的水平；李萌等〔14〕认为吡格列酮可改善缺血性脑损伤大鼠神经功能异常，减轻脑水肿并促进损伤脑细胞的恢复。本研究结果说明吡格列酮具有脑保护作用，这与文献〔13，14〕报道的结果一致。

研究〔15〕表明氧化应激、炎症反应、钙超载、能量代谢紊乱、酸中毒、细胞凋亡等与缺血再灌注脑损伤的发生密切相关，其中研究最多的是炎症反应。当前研究发现脑缺血再灌注损伤可能与脑细胞内多条信号转导通路有关〔16，17〕。TLR4受到刺激后会导致炎性细胞因子分泌增多，参与缺血性脑损伤中的炎症反应、神经功能损伤和神经细胞凋亡。NF-κB参与调控多种炎症反应及细胞因子，与脑缺血再灌注损伤有密切关系，脑缺血时会诱发NF-κB的活化，促使黏附分子、细胞表面受体、趋化因子和细胞因子表达增加，进一步加重缺血区的脑损伤程度。研究证实TLR4/NF-κB信号转导通路在脑缺血再灌注损伤过程中起着重要的作用〔18〕，刘军等〔19〕研究发现，TLR4对缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡具有保护作用。余伟军等〔20〕发现，脑缺血再灌注损伤后脑源性神经营养因子可能通过降低NF-κB活性，抑制炎症反应，减少细胞凋亡，从而在脑缺血再灌注损伤后，对神经细胞发挥保护作用。综上，TLR4/NF-κB信号转导通路的激活会加重脑缺血再灌注的炎症损伤。

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