RNA干涉5-脂氧合酶基因表达对结直肠癌细胞生长抑制及ROS含量、NF-κB通路的影响

金 强 姚晓玲 胡恩赑

(蚌埠市第三人民医院检验科，安徽 蚌埠 233000)

结直肠癌的发生发展是包含错配修复基因突变、抑癌基因缺失或失活及癌基因激活等多阶段、多基因的一个复杂过程，阐明结直肠癌发生发展的分子机制具有重要意义〔1〕。目前，多项研究显示肿瘤与脂质体代谢紊乱存在相关性，5-脂氧合酶(LOX)是花生四烯酸代谢的一个关键酶，在正常组织中低表达或不表达，而在前列腺癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤中过度表达，其过度表达可加速肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞分化和凋亡，且与淋巴结转移密切相关〔2～4〕。有研究显示，结直肠癌中5-LOX表达上调，且表达与淋巴结转移、分化程度、浸润深度和TNM分期有关〔5〕，5-LOX抑制剂可抑制癌细胞生长。RNA干扰是一种能使转录后的基因发生沉默的方法，具有高度的有效性、特异性，已成为研究基因功能有效的工具〔6〕。因此，本研究旨在观察抑制5-LOX表达后对人结直肠癌HCT116细胞活力、凋亡的影响及可能分子机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器 RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco；脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen；DCFH-DA荧光试剂购自美国Sigma；Bradford试剂盒、电化学发光法(ECL)发光试剂盒均购自碧云天生物；酶标仪及Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒均购自美国Thermo；CCK8试剂购自日本Tonjindo公司；5-LOX、p-IκBα、cyclinD1、Bcl-2抗体均购自美国Abcam；流式细胞仪购自美国Biorad。

1.2细胞培养及转染 人结直肠癌HCT116细胞购自中科院上海细胞库；HCT116细胞复苏后用RPMI1640培养基(含有10%小牛血清)常规培养和传代。实验选择生长至对数期的细胞。参照LipofectamineTM2000产品说明书进行瞬时转染。转染前1 d以每孔2.5×105个细胞接种于6孔板，每孔1 ml，共设置三组，分别为对照组(仅加入脂质体)、阴性对照组(NC组，无意义的siRNA系列)和si-5-LOX组(5-LOX的特异性siRNA干扰序列)，均委托广州锐博生物设计并合成，细胞达60%～75%生长融合时，换为不含血清和抗生素的培养液，参照转染说明进行转染，转染后于培养箱内培养5～6 h，换为含血清和无抗生素培养液，继续培养48 h，用于后续实验研究。

1.3蛋白质印迹 适量的RIPA裂解液提取转染si-5-LOX后48 h的各组HCT116细胞的总蛋白，Bradford试剂盒对蛋白浓度进行检测，蛋白样品与适量上样缓冲液混匀后100℃变性5 min，每孔中上样40 μg变性蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电冰(SDS-PAGE)，蛋白分离后通过电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脱脂奶粉于室温条件下封闭转好的PVDF膜1 h，洗膜，4℃摇床孵育5-LOX、p-IκBα、cyclinD1、Bcl-2和内参GAPDH抗体(皆按照1∶1 000稀释)过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温条件孵育1 h，洗膜，ECL发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。

1.4CCK8检测细胞活力 以每孔100 μl(约4×103个细胞)接种生长至对数期的HCT116细胞于96孔板，常规培养24 h后参照1.2方法转染，每组设置5个平行孔，于转染的24、48和72 h通过CCK8法检测细胞活力，检测前在每孔中加入CCK8试剂10 μl，培养箱孵育1 h，酶标仪测定450 nm吸光度值(OD值)，以OD值反映细胞活力，可以间接反映出细胞的增殖能力。实验重复3次。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI双染法进行荧光染色。预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤转染48 h的三组细胞，胰酶消化后重悬细胞于500 μl的Binding缓冲液，流式细胞仪检测凋亡情况。具体操作参照细胞凋亡试剂盒。实验重复3次。

1.6流式细胞仪检测活性氧(ROS)含量 PBS洗涤转染48 h的细胞，将细胞悬浮于含有DCFH-DA(终浓度为10 μmol/L)的无血清培养液中，避光、37℃培养箱孵育20 min，每间隔3～5 min颠倒一下，以保证细胞和探针能够接触充分，孵育完毕，使用培养基(不含血清)洗涤细胞3次，以除去没有进入细胞内的DCFH-DA，通过流式细胞仪在488 nm的激发波长和525 nm的最大发射波长检测。由于检测的荧光强度与细胞内的ROS水平表现出正相关，因此可用荧光强度大小反映细胞内的ROS水平。实验重复3次。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件，计量资料多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1转染5-LOX siRNA的HCT116细胞中5-LOX的表达 NC组5-LOX的蛋白表达(0.324±0.036)与对照组(0.311±0.034)差异无统计学意义(P>0.05)，而si-5-LOX组5-LOX的蛋白表达(0.131±0.015)显著低于对照组(P<0.05)。见图1。

图1 转染5-LOX siRNA的HCT116细胞中5-LOX的表达

2.2沉默5-LOX的表达降低HCT116细胞活力 与NC组比较，si-5-LOX组在24、48、72 h的细胞活力均显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 沉默5-LOX的表达对HCT116细胞活力的影响值，n=3)

与NC组比较：1)P<0.05；下表同

2.3沉默5-LOX表达诱导HCT116细胞凋亡 与NC组〔(2.36±0.45)%〕比较，si-5-LOX组细胞凋亡率〔(15.18±1.11)%〕显著升高(P<0.05)，对照组细胞凋亡率〔(2.24±0.41)%〕与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4沉默5-LOX的表达降低HCT116细胞ROS含量 与NC组(17.3±1.6)比较，si-5-LOX组的ROS含量(32.7±3.2)显著升高(P<0.05),对照组ROS含量(16.6±1.1)与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5沉默5-LOX的表达下调NF-κB信号通路 与NC组比较，si-5-LOX组p-IκBα的蛋白表达显著升高(P<0.05)，cyclinD1和Bcl-2的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见图2，表2。

图2 沉默5-LOX表达对NF-κB信号通路的影响

组别p⁃IκBαcyclinD1Bcl⁃2对照组0093±00130333±00340261±0026NC组0096±00120348±00360254±0024si⁃5⁃LOX组0194±00221)0164±00201)0137±00161)

3 讨 论

肿瘤细胞的增殖过快和凋亡减少是降低癌症患者生存率的一个主要原因，因此降低肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡可有效降低癌症患者的死亡率。近些年的研究显示，肿瘤细胞中5-LOX的促增殖和抑凋亡作用是引起肿瘤发生发展的一个重要环节。目前已发现在多种肿瘤中5-LOX出现过表达，其表达可促进肿瘤的发生发展〔7，8〕。有研究显示，通过RNA干扰技术抑制胰腺癌5-LOX表达可降低细胞增殖和诱导细胞凋亡〔9〕；抑制肝癌5-LOX表达可降低肝癌移植瘤的生长〔10〕。本研究发现转染后的细胞中5-LOX表达明显降低，且转染5-LOX的siRNA后的结直肠癌细胞活力明显降低，细胞凋亡率显著升高。有研究发现5-LOX抑制剂可抑制脑胶质瘤等多种肿瘤的增殖和诱导凋亡〔11〕。因此，本研究提示采用RNA干扰技术抑制5-LOX表达同样可能达到治疗结直肠癌的目的。

有研究证实，细胞内因氧化应激产生的ROS可能会作用于信号分子，对细胞的增殖、凋亡、分化、自噬等生命活动进行调控，细胞内大量的ROS积聚可引起细胞凋亡〔12，13〕。LOX是人体内活性氧产生的一个来源，其代谢产物既可以通过引起NADPH氧化产生ROS，也可以作为ROS而发挥直接的效应〔14〕。有研究显示，5-LOX抑制剂可降低细胞内的ROS水平〔15〕。NF-κB是一种重要的核转录因子，参与肿瘤、免疫、炎症等的发生发展；静息状态下，NF-κB可与抑制因子IκBɑ结合而在细胞质中滞留，当细胞被应激状态或外界刺激影响时，会将相应的信号传导通路启动，使IKK激活，引起IκBɑ发生磷酸化，并使其降解，从而将NF-κB释放入核而行使转录因子功能，诱导cyclinD1、Bcl-2等靶基因的表达〔16，17〕。cyclinD1与细胞增殖有密切相关，Bcl-2是Bcl-2家族一员，发挥抑凋亡作用，多项研究显示结直肠癌中NF-κB信号被激活，可引起cyclinD1和Bcl-2表达升高〔18〕。也有研究发现，5-LOX抑制剂可通过下调Bcl-2和cyclinD1等途径抑制多种肿瘤的生长〔19，20〕。本研究的结果显示，抑制结直肠癌细胞中5-LOX表达后，细胞内的ROS含量明显升高，磷酸化的IκBɑ表达升高，Bcl-2和cyclinD1表达降低。提示5-LOX对结直肠癌细胞增殖凋亡的影响可能是通过提高细胞内ROS含量及下调NF-κB信号实现的。

综上所述，抑制结直肠癌细胞5-LOX的表达可降低细胞活力及诱导细胞凋亡，其机制可能与降低细胞内ROS含量和下调NF-κB信号通路有关。本研究提示通过RNA干扰技术抑制结直肠癌中高表达的5-LOX可能是其防治的一种方法，但本研究的内容有限，因此还需更多的理论进行证实。

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