下调Six1基因表达对胃癌细胞生物学特性及B7-H1表达的影响

王建华 王伟伟 王卫国

(阜阳市人民医院检验科，安徽 阜阳 236000)

胃癌患者发现时多数已处于中晚期，研究对胃癌转移、侵袭影响的机制对于早期发现及靶向治疗具有重要意义〔1〕。Six1是同源异形盒(Hox)基因家族的成员，在多种生物中均有表达，且参与多种肿瘤的发生发展〔2〕。有研究显示，在宫颈癌、肺癌等多种肿瘤中Six1呈高表达，其高表达不仅能导致细胞发生恶性增生，且参与肿瘤的转移和侵袭过程，但调控的具体机制目前尚未完全明确〔3,4〕。有研究显示，胃癌中Six1表达明显增高，其表达与肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期等明显相关，可能是胃癌预后评估的一个独立生物标志物〔5〕；沉默胃癌中Six1的表达可降低细胞的克隆形成数、诱导细胞凋亡及增加对5-氟尿嘧啶化疗的敏感性〔6〕。但Six1对胃癌细胞侵袭及B7-H1表达的影响尚未清楚。本研究通过RNA干扰技术沉默胃癌细胞Six1的表达，旨在探讨Six1对癌细胞增殖侵袭、B7-H1表达的影响。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂和仪器 人正常胃黏膜上皮细胞GES-1及胃癌MKN45、AGS和BGC823细胞均购自中国科学院上海细胞库；DMEM培养基、胰蛋白酶、MTT试剂均购自美国Gibco；Bradford蛋白定量试剂盒购自北京百泰克生物；Transwell小室购自美国Coming Costar；Six1、B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、细胞周期蛋白(cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体均购自美国Abcam；酶标仪购自美国Bbio-TEK；流式细胞仪购自美国BD。

1.2细胞培养 GES-1、MKN45和BGC823细胞采用DMEM培养基，AGS细胞用F12K培养基，于5%体积分数的CO2、饱和湿度培养箱中37℃培养，隔天换液，细胞生长达85%左右融合时，胰酶消化后传代。实验选择生长至对数期的细胞。

1.3细胞转染 转染前1 d以1×106/ml接种生长至对数期的BGC823细胞(2 ml无抗生素培养液)于6孔板，以便次日转染时细胞生长融合可达60%～80%。转染参照脂质体LipofectamineTM2000转染说明进行操作，分别转染NC组(非特异性siRNA)和si-Six1(转染Six1特异性的siRNA的干扰组)，并设置仅加入脂质体的为空白对照组，转染后于5%体积分数的CO2培养箱中37℃培养6 h，换为含血清的DMEM培养基继续培养48 h用于后续实验研究。

1.4Western印迹检测蛋白表达 胰酶消化离心生长至对数期的GES-1、MKN45、AGS和BGC823细胞及按照1.3分组转染48 h的细胞，加入细胞裂解液，反复吹打以使细胞能够充分裂解，裂解完全后离心，收集上清(上清为提取的蛋白)，Bradford法对蛋白进行定量，取上清液50 μg与2倍十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液按照4∶1比例充分混匀，100℃煮沸变性，每孔道上样40 μg变性蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)(10%)后，电转移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭转好的PVDF膜1 h，4℃摇床孵育已稀释好的Six1、B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1、MMP-2和内参GAPDH抗体(按照1∶500～1 000稀释)过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育2 h，ECL化学发光显影。凝胶自动分析软件进行分析。以Six1、B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1、MMP-2与内参GAPDH的吸光度比值作为各蛋白的相对表达量。

1.5MMT法测定各组细胞活力 每孔5×103个细胞接种生长至对数期的BGC823细胞于96孔板，培养箱内常规培养24 h后参照1.3分组转染，于转染的48 h在每孔中加入MTT液(5 mg/ml)20 μl，继续培养5 h，除去培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，室温摇床混匀15 min，酶标仪测定各孔吸光度值(OD值，490 nm)。实验重复3次。

1.6Transwell小室测定各组细胞侵袭能力 4℃冰箱解冻Matrigel胶，与无血清的DMEM培养液按照1∶8比例混合均匀，每孔加入80 μl铺在24孔Transwell小室上室，于培养箱内37℃培养3 h，收集按照1.3分组转染48 h的各组细胞，胰酶消化后制备成单细胞悬液，每孔5×103个接种在上室，放置上室于24孔板中，加入无血清的培养液250 μl在上室中，下室中加入含血清的培养液750 μl，培养箱内培养24 h后取出小室，棉签轻轻擦掉上室底部基质胶及未侵袭的细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后甲醇固定30 min，结晶紫染色20 min，室温风干，随机选择5个视野，显微镜下计数，求均值。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1胃癌细胞中Six1的表达 胃癌MKN45、BGC823和AGS细胞中Six1的蛋白表达(0.237±0.026，0.555±0.049，0.387±0.041)均显著高于在GES-1细胞中的表达(0.102±0.011，P<0.05)，见图1。

图1 胃癌细胞中Six1的表达

2.2si-Six1转染抑制BGC823细胞活力及侵袭能力 MTT及Transwell小室检测结果显示，与NC组比较，si-Six1组细胞活力及侵袭能力均显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 si-Six1转染抑制BGC823细胞活力及侵袭能力

与NC组比较：1)P<0.05；下表同

2.3si-Six1转染BGC823细胞效果 si-Six1转染BGC823细胞48 h，si-Six1组Six1的表达(0.091±0.010)显著低于空白对照组(0.342±0.035，P<0.05)，而NC组(0.334±0.032)与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 si-Six1转染BGC823细胞后各组细胞Six1的蛋白表达

2.4si-Six1转染降低BGC823细胞B7-H1蛋白表达 Western印迹检测显示，与NC组(0.508±0.051)比较，si-Six1组B7-H1蛋白表达(0.108±0.011)显著降低(P<0.05)，空白对照组(0.529±0.056)与NC组差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图3 si-Six1转染对BGC823细胞B7-H1蛋白表达的影响

2.5si-Six1转染下调BGC823细胞JAK2/STAT3信号 Western印迹检测结果显示，与NC组比较，si-Six1组p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1和MMP-2的蛋白表达均显著降低(均P<0.05)，见图4，表2。

图4 si-Six1转染对BGC823细胞p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1、MMP-2蛋白表达的影响

组别p⁃JAK2p⁃STAT3cyclinD1MMP⁃2空白对照组0111±00100173±00200452±00480257±0026NC组0121±00130157±00180471±00500280±0028si⁃Six1组0047±00071)0038±00061)0146±00181)0141±00151)

3 讨 论

Hox是在进化高度保守的一类DNA序列，Six1是新近发现的Hox家族成员，Six1在Six家族中研究最多，有研究显示，Six1蛋白是多种器官发育所必需的，可维持细胞生存，细胞周期及抑制细胞凋亡〔7,8〕。多种肿瘤中Six1出现过表达，可促进细胞增殖、分化，活化细胞周期，但其作用机制尚未清楚。但也有研究指出，抑制肿瘤中Six1的表达可降低其发生发展〔9〕。如宫颈癌中上调Six1表达可加快癌细胞增殖，增加细胞侵袭能力，缩短细胞周期，而下调Six1表达后细胞增殖及侵袭能力均显著降低，且阻滞细胞在G2/M期〔10〕；肺癌中下调Six1表达后癌细胞的增殖及迁移能力均明显降低〔11〕。

RNA干扰是沉默基因表达的一种方法，由于其可有效抑制分裂期和非分裂期细胞，且具有特异性、高效性等优势，已广泛应用于基因治疗和基因功能研究等方面〔12，13〕。本研究结果显示，RNA干扰Six1后BGC823细胞中Six1的表达明显降低，且可有效降低细胞的活力及侵袭能力，提示抑制Six1表达可降低胃癌的发生发展。B7-H1是B7家族中的一员，是一种重要的负性协同刺激分子，可介导肿瘤发生免疫逃逸〔14〕。有研究显示，胃癌中B7-H1的表达升高，与TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润深度等有关，可能是判断胃癌预后的一个新指标〔15〕。在卵巢癌细胞与巨噬细胞非接触共培养后，可发现两种细胞B7-H1表达均比非培养组有明显增高，而抑制JAK2/STAT3等信号通路后B7-H1的表达受到抑制〔16〕。这提示抑制JAK2/STAT3信号可能影响B7-H1的表达。JAK2/STAT3的活化与胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的恶化有关〔17.18〕，有研究显示，阻断肝癌JAK2/STAT3信号可降低癌细胞增殖，且下调下游分子survivin〔19〕，抑制胃癌中JAK2/STAT3信号可降低肿瘤细胞侵袭能力，且下调下游分子MMP-2和MMP-9的表达〔20〕。本研究结果提示Six1可通过下调JAK2/STAT3信号影响胃癌的增殖、侵袭及免疫。

综上，下调胃癌细胞Six1表达可降低癌细胞活力及侵袭能力，降低B7-H1表达，机制可能是抑制JAK2/STAT3信号通路。Six1可能是胃癌分子诊疗的一个新的靶点，值得进一步深入的研究。

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