大豆分离蛋白、卡拉胶与肌原纤维蛋白间的相互作用

康伟

（天津生物工程职业技术学院，天津300462）

肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）是一种重要的功能性蛋白质，在肌肉蛋白质中占到55%左右，除赋予肉制品特有的风味、口感和营养外，其功能特性，如乳化性和凝胶性等还对产品的质构和感官起重要的作用。大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）由于营养丰富、含有人体必需氨基酸、不含胆固醇并且价格低廉等特点在肉制品加工生产中应用较多，同时，大豆分离蛋白作为一种优质的植物蛋白，具有良好的持水性、乳化性、凝胶性等特点，将其添加到肉制品中，可降低蒸煮损失、防止肉汁离析、促进水分和脂肪的吸收、改善口感等，可以显著的改善产品品质，从而达到提高产量的目的[1-3]。当SPI应用于肉制品时，由于SPI的变性温度远高于普通肉制品加热的最高温度，导致SPI不能与肌原纤维蛋白发生充分的相互作用[4-5]，因此，研究大豆蛋白和其他食用物质进行复配，从而有效的提高肌原纤维蛋白的功能特性。卡拉胶（carrageenan，简称CAG）是一种硫酸酯海藻多糖，由于其中硫酸酯基含量和结构的不同，因此卡拉胶具有多种类型。κ-卡拉胶具有极强的形成凝胶的能力，在肉蛋白加热形成凝胶过程中起到显著的保水和凝胶增强作用，因此在香肠、午餐肉等熟肉制品中应用较广。本研究将不同添加比例的CAG、SPI和CAG+SPI复配物添加到肌原纤维蛋白中形成复合蛋白体系，研究对复合蛋白乳化特性，复合凝胶持水性、质构特性、白度和微观结构的影响，并讨论了CAG、SPI及二者复配对肌原纤维蛋白乳化和凝胶特性影响的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪背部最长肌：大润发超市；大豆分离蛋白（食品级，纯度99%）：郑州市红展化工产品有限公司；卡拉胶（食品级，纯度99%）：湖南维兴生物科技有限公司；试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

YJ-DTF型精密电子天平：常州市幸运电子设备有限公司；TDL-5M冷冻离心机：常州市仪都仪器有限公司；HH-S6数显恒温水浴锅：金坛市精达仪器制造有限公司；雷磁PHBJ-260型便携式酸度计：上海宝赛生物科技有限公司；T18高速匀浆机：德国IKA公司；美谱达UV-1800紫外可见分光光度计：浙江赛德仪器设备有限公司；TEX-AN 200型质构分析仪：法国LAMY公司；NR10QC通用色差计：北京京海正通科技有限公司；KH-7700型扫描电子显微镜：日本浩视公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

根据Xiong等[6]的方法进行肌原纤维蛋白的提取。将瘦肉切碎，加入4倍体积10 mmol磷酸盐、0.1 mol NaCl、2 mmol MgCl2和1 mmol乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（Ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EGTA）（pH 7.0）配制成的蛋白提取液均质60 s。用冷冻离心机将匀浆液置于4℃条件，离心转速3 500 r/min离心15 min，之后倒掉上清，进行3次重复。再加入4倍体积的0.1 mol/L NaCl溶液匀浆，3 500 r/min下离心15 min，重复3次。最后一次将均质后溶液，用纱布进行过滤，得到的溶液用0.1 mol/L HCl调节pH值为6.0，继续进行离心，倒掉上清液，收集沉淀。提取需在4℃条件下进行，提取后的肌原纤维蛋白置于4℃的冰箱备用。

1.3.2 复合蛋白体系及凝胶制备

本试验共分为4组，添加SPI、CAG和SPI+CAG复合蛋白体系及凝胶的制备如表1。

表1 复合蛋白体系的制备Table 1 Preparation of complex protein system %

肌原纤维蛋白浓度为40 mg/mL，复合蛋白体系混匀搅拌30 min，进行以下乳化活性和乳化稳定性的测定，将复合蛋白体系在80℃水浴加热30 min制备凝胶，冷却后置于4℃隔夜保藏，测定以下指标。

1.3.3 复合蛋白乳化活性及乳化稳定性的测定

根据Pearce等[7]的方法。复合肌原纤维蛋白溶液的乳化活性（Emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性（Emulsifying stability index，ESI），计算公式如下：

式中：A500为500 nm波长处的吸光度；φ为油相体积分数（φ =0.2%）；A0、A10为乳状液在 0、10 min的吸光度；c为初始蛋白质溶液中蛋白浓度，g/mL；dilution为稀释倍数。

1.3.4 复合蛋白凝胶持水性（Water holding capacity，WHC）测定

将凝胶从4℃冷藏中取出于室温下静置30 min，之后转移到50 mL的离心管中，在4℃条件下，转速3 500 r/min离心30 min。将离心管倒置20 min后，用吸水纸吸取凝胶析出的水分，进行称重。

WHC/%=离心后凝胶净重/离心前凝胶净重×100

1.3.5 复合蛋白凝胶质构的测定

将蛋白凝胶取出于室温静置30 min，参考王博等[5]的方法并略作修改。将待测样品平放于测定平台上，利用物性分析仪进行测量。参数设定如下：探头型号选择P/50，下压距离50%，触发力为5 g，测试前速率为5 mm/s，测试速率为2 mm/s，测试后速率为5 mm/s。每个样品进行6次重复试验。

1.3.6 复合蛋白凝胶白度值（Whiteness，W）的测定

使用色差计测定凝胶的色差，即L*值（亮度值），a*值（红度值），b*值（黄度值）。试验过程中每个样品均进行3次平行试验，试验结果取平均值。并根据Park[8]的方法进行白度值计算：

1.3.7 复合蛋白凝胶微观结构的观察

参考王博等[5]的方法进行复合蛋白凝胶微观结构的观察。

1.3.8 数据统计方法

本试验用 Statistix 8.1软件对数据作出分析，SigmPlot 12.0软件进行作图，每组数据均做3次独立的重复平行试验。

2 结果与分析

2.1 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白乳化性能的影响

图1为添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG复合蛋白的乳化活性（图1A）和乳化稳定性（图1B）的变化。

当添加浓度0时，即纯MP对照组。从图1可看出，添加SPI、CAG和SPI+CAG的混合蛋白乳化活性和乳化稳定性均显著高于MP，随着添加比例的增加呈现显著上升的趋势（P＜0.05），复合蛋白的乳化活性和乳化稳定性按大小排序均为：SPI+CAG＞CAG＞SPI，且在同一浓度梯度条件下，SPI+CAG复合蛋白的乳化活性和乳化稳定性均显著高于SPI和CAG复合蛋白（P＜0.05）。

图1 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响Fig.1 Effects of soy protein isolate and carrageenan on the emulsifying activity and emulsification stability of myofibrillar protein

当SPI、CAG和SPI+CAG添加量为最大时，与MP组相比，复合蛋白的乳化活性分别提高了47%、84%和96%，同时，复合蛋白的乳化稳定性分别提高了92%、149%和166%。SPI作为一种天然乳化剂，乳化性能好，能很好的促进油脂吸收或蛋白与油脂结合，形成稳定性较好的乳状液，同时，经加热后的SPI球蛋白，通过随机链接会形成一些可溶性聚集束，通过疏水键相互作用后会形成蛋白凝胶[5，9]，具有保水保油性、乳化稳定性等功能特性，在肉制品中应用较多。有研究表明，卡拉胶作为一种阴离子多糖可以与肌原纤维蛋白发生相互作用，提高蛋白的持水、持油能力，从而形成稳定的复合蛋白体系。由于多糖和蛋白质均具有稳定的乳化特性，在乳化过程中蛋白分子通过吸附在油水界面上，从而可形成具有一定粘弹性的保护膜，因此，推断多糖和蛋白质混合物也会具有良好的乳化特性[9-10]，在本试验中，在MP中添加SPI和CAG复配物，二者协同作用使复合体系的乳化性能显著提高。

2.2 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白凝胶持水性的影响

图2表示添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG复合蛋白凝胶持水性的变化。

从图2可以看出，与MP组相比，添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG复合蛋白凝胶持水性均呈上升趋势，且随着添加量增加，凝胶的持水性增大，其中添加CAG和SPI+CAG均能显著提高肌原纤维蛋白凝胶的持水性（P＜0.05），当添加量为最大时，CAG和SPI+CAG的凝胶保水性较MP组分别提高了11%和8%，但二者间不存在显著差异（P＞0.05）。之前研究表明，肉和非肉蛋白的相互作用会影响产品凝胶的特性，对产品的结构起到一定修饰的作用[11]，SPI的肽链骨架上含有很多极性基，因此具有很好的吸水性和保水性，最高可吸收并保持自身质量14倍的水分。卡拉胶作为典型的亲水胶体，含有丰富的强阴离子性硫酸酯基团，可以与凝胶内部和外部游离的水分子结合，形成氢键，最多可吸收自身质量40～50倍的水分[12]，因此，在肌原纤维蛋白形成凝胶的过程中，添加卡拉胶可将肌原纤维蛋白凝胶体系中游离水转变为不易流动水滞留在凝胶网络结构中，显著提高了复合凝胶的持水性能[13]。同时，添加SPI+CAG的复合凝胶兼具SPI和CAG的优点，具有较好的保水效果。

图2 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白凝胶持水性的影响Fig.2 Effect of soy protein isolate and carrageenan on water holding property of myofibrillar gel

图3 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白凝胶硬度和弹性的影响Fig.3 Effects of soy protein isolate and carrageenan on the hardness and springness of myofibrillar gel

2.3 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白凝胶质构特性的影响

添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG复合凝胶的硬度（图3A）和弹性（图3B）的变化如图3所示。

由图3A可知，添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG的复合凝胶处理组硬度均显著高于MP组（P＜0.05），且随着添加量的增加，3种复合凝胶的硬度均呈现显著增加的趋势（P＜0.05），其中添加SPI的凝胶硬度增加最为显著。当最大添加量时，SPI、CAG和SPI+CAG的复合蛋白比MP分别提高了79%、63%和70%。由图3B可知，添加SPI的凝胶弹性无显著变化（P＞0.05），CAG和SPI+CAG复合凝胶的弹性均显著高于MP（P＜0.05），且添加CAG复合凝胶在添加量为0.6%时差异显著（P＜0.05），比MP提高了4%，而添加SPI+CAG复合凝胶在添加量为2.4%和3.6%时差异显著（P＜0.05），比MP分别提高了4%和5%。肌原纤维蛋白在加热过程中，蛋白受热结构打开会形成具有三维网络状结构的凝胶基质，可将水分子及其他组分束缚进蛋白结构中，而添加SPI的复合蛋白的加热过程中，可将SPI截留进蛋白凝胶基质中，从而增加了凝胶的硬度和弹性[14]，同时，加热后的SPI，其蛋白分子从天然状态解折叠，亚基解离并形成部分的可溶性聚集体，从而增强蛋白质分子内及与水分子间的相互作用[12]。之前的研究表明卡拉胶作为一种阴离子多糖，能与肌原纤维蛋白分子发生相互作用，将蛋白有效地结合在卡拉胶形成的胶体体系内，提高蛋白凝胶的质构特性[3]，此外，卡拉胶在蛋白凝胶形成过程，能吸收大量水分，将游离水分子束缚进蛋白凝胶网格中，增强凝胶硬度和弹性。郝娟等[1]研究表明，大豆分离蛋白对鸡肉肠的硬度的影响要远大于卡拉胶，这与我们的研究结果一致。

2.4 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响

图4为添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG复合蛋白凝胶白度的变化。

由图4可知，除添加CAG对蛋白凝胶无显著影响外（P＞0.05），添加SPI和SPI+CAG复合蛋白凝胶的白度值均低于MP凝胶对照组，并且随着添加比例的增大，复合凝胶的白度值呈显著降低的趋势（P＜0.05），添加SPI的复合凝胶白度值在2.4%和3.6%时显著下降，较MP组降低了5%和6%，而SPI+CAG在3.6%时显著下降，较MP组降低了4%。因为SPI本身呈现淡黄色，向MP凝胶中添加SPI会使得其白度值降低[15]，但SPI、SPI+CAG添加量较小时，其对凝胶白度影响不大。由于卡拉胶溶于水后形成澄清透明的溶液，将其加入到肌原纤维蛋白凝胶中对凝胶白度的影响不显著[16]。从图4中可看出，SPI+CAG复合蛋白凝胶的白度介于SPI和CAG复合凝胶之间，表明添加卡拉胶可在一定程度上减轻SPI对凝胶白度的影响，因此，由于SPI会对肌原纤维蛋白颜色有不利的影响，在肉制品生产加工应用时应适量添加。

图4 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响Fig.4 Effects of soy protein isolate and carrageenan on the whiteness of myofibrillar gel

图5 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白凝胶凝胶微观结构的影响Fig.5 Effect of soy protein isolate and carrageenan on the microstructure of myofibrillar protein gels

2.5 大豆分离蛋白和卡拉胶对肌原纤维蛋白凝胶微观结构观察

添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG复合蛋白凝胶的微观结构的如图5所示。

通过观察复合凝胶电镜图发现，MP凝胶网络结构趋于松散，形成较大的不规则孔洞，蛋白质排列杂乱，有明显的断层，蛋白间的交联较稀疏：添加SPI的复合凝胶结构较MP凝胶而言，网络结构松散无序程度降低，但仍存在较多孔洞。而添加CAG组凝胶结构较为规则，孔洞也较小：添加SPI+CAG凝胶结构比较规则，无较多较大的孔洞，网络结构较致密均匀，网格细小，蛋白质间形成明显交联。由于大豆分离蛋白和卡拉胶复配具有较强的油-水结合能力，形成较稳定的蛋白质-多糖的复合体系，这对于致密稳定的蛋白凝胶形成有很大的促进作用，因此，SPI+CAG复合蛋白凝胶的结构最好。相较之下，CAG组的凝胶结构要比SPI组更规则致密，可能是卡拉胶结合水分子的能力要强于SPI，可以将更多的游离水分束缚进凝胶结构[12，16]，从而使蛋白网络孔洞减少，形成较致密的网络结构。

3 结论

通过对复合蛋白乳化特性、凝胶持水性、质构特性、白度和微观结构的测定，可得出，添加SPI、CAG及SPI+CAG复配物的复合蛋白，其乳化活性、乳化稳定性、持水性和硬度均显著高于MP（P＜0.05），且添加量越大，其增强效果越显著；而添加SPI的弹性无明显变化（P＞0.05），添加SPI+CAG复配物的弹性显著增加（P＜0.05）；复合凝胶的白度值比MP有所下降，添加CAG的白度值无显著差异（P＞0.05），而添加SPI显著降低（P＜0.05）。观察凝胶微观结果可知，与MP相比，3种添加物均能改善复合凝胶结构，使其趋于致密均匀，其中添加SPI+CAG复配物的效果最为显著（P＜0.05）。

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