基于SIRT1/TGF-β1/Smad通路研究三七皂苷对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响

潘晶 章科娜 柴可夫 钱俊文 杜月光

浙江中医药大学基础医学院 杭州 310053

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的并发症，也是糖尿病患者主要死因之一。DN的主要病变特点为肾小球和肾小管间质区的纤维化。研究发现，肾上皮细胞发生上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）与肾纤维化的过程有关[1]。EMT是指上皮细胞转变为间充质细胞的现象。近年有研究表明肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转变，与肾脏病变的发展及肾功能障碍密切相关[2]。与EMT发生相关的通路有很多，其中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/细胞因子Smad是目前研究最多的。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1） 是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）依赖的组蛋白去乙酰化酶，与抗氧化应激、抗细胞衰老及调节能量代谢等细胞活动有关[3]。近年研究提示，可通过激活SIRT1使Smad3、Smad4去乙酰化，进而抑制TGF-β1/Smad途径，阻止EMT的发生[4-5]。

三七是我国的名贵中药，具有止血、散血、定痛等功效，在临床上应用广泛。三七皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）为其主要有效成分，药理作用涉及抗氧化、抗纤维化、调节免疫和改善微循环等多个方面[6]。临床研究证实PNS治疗DN安全、有效。前期研究发现PNS可降低DN大鼠TGF-β1表达，升高骨形态发生蛋白7（bone morphogenic protein 7，BMP7）的表达，具有抗肾纤维化，保护肾脏的作用[7-8]。但PNS是否通过激活SIRT1，抑制肾小管上皮细胞EMT的发生从而起到抗肾纤维化作用，尚未见明确报道。为此，本研究通过观察PNS对高糖诱导下的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响，从SIRT1/TGF-β1/Smad通路探讨其机制，为PNS治疗DN进一步提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株来源及主要试剂 大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）购于中国科学院上海分院。DMEM培养液（批号：C11885500BT）、胎牛血清购于美国Gibco公司。PNS购于云南植物药业有限公司。白藜芦醇（resveratrol，RSV）购于美国ApexBio公司（批号：A4182）；SIRT1抑制剂EX527购于美国 ApexBio公司（批号：A4181）；α-SMA 抗体（批号：ab21027），E-钙黏着蛋白（E-cadherin，E-cad）抗体（批号：ab76055）、SIRT1抗体（批号：ab166821）、TGF-β1抗体（批号：ab179695）均购于美国Abcam公司。BAC蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0010）。Real-time RT-PCR试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司（批号：CW2695）。逆转录试剂盒scriptTMg DNA Clear cDNA Synthesis Kit购于美国 Bio-Rad公司（批号：1725035）。

1.2 细胞培养 NRK-52E细胞复苏后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2的条件下常规培养。采用胰蛋白酶消化传代，2～3d传代1次，传代3次后用于实验。待细胞成长铺满培养瓶70%～80%时，用无血清DMEM培养基同步12～16h。

1.3 细胞分组及干预 本研究中所用药物浓度依据参考文献及前期预实验结果确定[9-10]。实验分组为：①正常对照组（normal control group）：细胞以含有5.5mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液培养；②高糖组（high glucosegroup，HG group）： 细 胞 以 含 有30mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液培养；③RSV组：细胞以含有 30mmol·L-1葡萄糖和 50μg·mL-1RSV 的DMEM培养液培养；④EX527组：细胞以含有30mmol·L-1葡萄糖和 10μmol·L-1EX527 的 DMEM培养液培养；⑤PNS组：细胞以含有30mmol·L-1葡萄糖和 100μg·mL-1PNS的 DMEM 培养液培养；⑥EX527+PNS组：细胞以含有30mmol·L-1葡萄糖和10μmol·L-1EX527 的 DMEM 培养液培养，EX527 干预1h后再加入终浓度为100μg·mL-1的PNS。各组继续培养48h后收集细胞，用于进一步实验。

1.4 免疫组化检测细胞内α-SMA、E-cad蛋白表达细胞接种于6孔板，体积20μL/孔，细胞数量约1×105个，每组设3个复孔。细胞铺满爬片后，弃去上清液，PBS清洗3次，10%多聚甲醛溶液室温固定细胞30min，PBS 洗片 3次，加入 0.5%TritonX-100，洗净后分别加入 α-SMA（1:100）、E-cad（1:100）一抗，放置于湿盒上防止干燥，4℃孵育过夜；PBS洗片3次，分别加入二抗（α-SMA为鼠抗，E-cad为兔抗），37℃孵育1h，PBS洗净后显微镜下DAB显色，苏木素复染，水洗，树胶封片，显微镜下观察。

1.5 Real-time RT-PCR检测细胞内SIRT1、TGF-β1、α-SMA、E-cad、Smad3、Smad4 mRNA 的表达收集细胞，按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，检测并计算RNA的纯度和浓度，使用逆转录试剂盒转录为cDNA，用SYBR Green荧光法进行PCR扩增。PCR引物序列由上海生工生物工程公司合成，具体序列见表1。反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火延伸1min，共40个循环。每个样本设置3个复孔。取其循环阈值（Ct）均值，计算各组的△Ct，以 2-△△Ct表示基因的相对表达量（△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值，△△Ct=各实验组△Ct值-正常对照组△Ct值）。

1.6 Western blot检测细胞内 SIRT1、TGF-β1、α-SMA、E-cad蛋白的表达 收集细胞，采用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，然后采用BCA定量试剂盒进行蛋白浓度定量。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，每孔上样量60μg，电泳 2h左右。完毕后转移至PVDF膜上，转膜结束后，放到T-TBS（含5%脱脂奶粉），室温封闭1h，分别加入一抗SIRT1（1:2 500）、α-SMA（1:500）、E-cad（1:500）、TGF-β1（1:1 000）等，4℃孵育过夜。洗膜后加入二抗（1:5000）室温孵育1h，显色，采用Super Signal West Dura Extended Duration Substrate显影和定影，Image J软件分析条带的光密度值。目的蛋白相对表达量=[目的蛋白（光密度值）/内参蛋白（光密度值）]×10表示。

表1 PCR引物序列Tab.1 The sequence of the primers of PCR

1.7 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD-t法），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞内α-SMA和E-cad蛋白的表达 免疫组化结果显示，正常对照组细胞质内仅有极少量α-SMA的表达，细胞膜上E-cad表达明显；高糖组细胞α-SMA的表达增加，E-cad表达减低，RSV组和PNS组均可见α-SMA的表达减低，E-cad表达增加，EX527+PNS组α-SMA的表达减低不明显，E-cad表达增加不明显。见图1、2。

图1 各组细胞内α-SMA的表达（200×）Fig.1 The expression of α-SMA in each group(200×)

图2 各组细胞内E-cad的表达（200×）Fig.2 The expression of E-cad in each group(200×)

2.2 各组细胞内α-SMA和E-cad mRNA的表达与正常对照组比较，高糖组α-SMA mRNA表达增高（P＜0.05），E-cad mRNA 明显减低（P＜0.01）。与高糖组比较，RSV组和PNS组α-SMA mRNA表达均减低（P＜0.05），E-cad mRNA 表达均增高（P＜0.01）；以EX527抑制SIRT1后，EX527+PNS组α-SMA mRNA表达高于PNS组（P＜0.05）、E-cad mRNA的表达则低于 PNS组（P＜0.01）。见图 3。

图3 各组细胞内α-SMA和E-cad mRNA的表达Fig.3 The mRNA expression of α-SMA and E-cad in each group

2.3 各组细胞内 TGF-β1、SIRT1、Smad3 和 Smad4 mRNA表达的变化 与正常对照组比较，高糖组细胞TGF-β1、Smad3和 Smad4 mRNA 表达增高（P＜0.05或P＜0.01），SIRT1 mRNA 表达明显减低（P＜0.01）；与高糖组相比，RSV 组和 PNS组细胞 TGF-β1、Smad3和Smad4 mRNA 表达均减低（P＜0.05或 P＜0.01），SIRT1 mRNA 增高（P＜0.01）。EX527+PNS 组 TGF-β1、Smad3和Smad4 mRNA表达高于 PNS组（P＜0.05或 P＜0.01）、SIRT1 mRNA 的表达则低于 PNS 组（P＜0.01）。见图 4、5。

2.4 各组细胞内α-SMA和E-cad蛋白表达 Western blot检测发现，与正常对照组比较，高糖组细胞α-SMA蛋白表达增高（P＜0.01），E-cad蛋白表达减低（P＜0.01）。与高糖组比较，RSV组和PNS组细胞α-SMA蛋白表达减低（P＜0.01），E-cad蛋白表达增高（P＜0.01）。与PNS组比较，EX527+PNS组细胞α-SMA蛋白表达增高（P＜0.01），E-cad蛋白表达减低（P＜0.01）。见图6。

图4 各组细胞内TGF-β1和SIRT1 mRNA的表达Fig.4 The mRNA expression of TGF-β1and SIRT1 in each group

图5 各组细胞Smad3和Smad4 mRNA的表达Fig.5 The mRNA expression of Smad3 and Smad4 in each group

图6 各组细胞内α-SMA and E-cad蛋白的表达Fig.6 The protein expression of α-SMA and E-cad in each group

2.5 各组细胞内TGF-β1和SIRT1蛋白表达 与正常对照组比较，高糖组细胞SIRT1的蛋白表达减低（P＜0.01），TGF-β1表达增高，差异明显（P＜0.01）。与高糖组相比，RSV组和PNS组细胞SIRT1表达明显增高（P＜0.01），而 TGF-β1则减低（P＜0.01）。与 PNS组比较，EX527+PNS组细胞内SIRT1蛋白表达低于PNS组（P＜0.01），而TGF-β1表达高于PNS组（P＜0.01）。见图7。

图7 各组细胞内TGF-β1和SIRT1蛋白的表达Fig.7 The protein expression of TGF-β1and SIRT1 in each group

3 讨论

DN是糖尿病最常见的并发症，也是导致终末期肾衰竭（end stage renal disease，ESRD）的主要原因之一。其主要病变特点为肾小球和肾小管间质区域细胞外基质（extracellular matrix,ECM）发生进行性积聚，导致肾小球和肾小管间质区的纤维化。目前认为，肌成纤维细胞与肾纤维化的发生关系最为密切，不但直接参与细胞基质成分的过度合成和沉积，而且可以破坏原有的肾脏结构[11-12]。Iwano等[13]对单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral occlusion，UUO）大鼠模型的研究发现，肾间质中新形成的成纤维细胞约有36%来源于EMT，由此可见EMT在DN肾间质纤维化中起着重要作用。

EMT是一种由不能移动的有极性的上皮细胞转化为间充质细胞的过程。在病理状况下，上皮细胞发生去极化，丧失极性，转化为间充质细胞形态，细胞黏附能力下降，且这种改变通常伴有细胞间粘连蛋白如E－cad和γ－连环蛋白的表达下降，肌动蛋白骨架重组，间充质细胞表型激活，间充质细胞标志物如成纤维细胞特异蛋白-1（fibroblast specific protein-l，FSP-1）、α-SMA等活化，细胞迁移和运动的能力增强[14]。本实验通过高糖刺激大鼠肾小管上皮细胞，结果显示细胞膜上的E-cad表达减低，而细胞质内的α-SMA表达增加，提示高糖可导致肾上皮细胞发生EMT，与既往研究一致[9]。

许多因素可以诱导或促进EMT的发生，其中TGF-β1被认为是EMT过程的主要诱导因子。TGF-β1与TGF-βR结合，同时形成同源二聚物，发放跨膜信号诱导Smad2/3活化，并与Smad4组成混合体，激活细胞内Smad4通路，负调节E-cad蛋白表达，上调波形蛋白、纤维粘连蛋白等间充质细胞表型蛋白的表达，介导细胞迁移能力的提高，促进EMT的发生，可见TGF-β1/Smad是EMT发生的一条重要的信号通路[15]。本实验结果表明，高糖作用下细胞TGF-β1、Smad3、Smad4表达上升，提示该通路被激活，可能与肾小管上皮细胞EMT有关。R-Smads的活性除了受到磷酸化水平的影响，也受到乙酰化水平的调节。

SIRT1是一种依赖于NADH的组蛋白去乙酰化酶，在调节及维持细胞能量代谢中有重要作用[16]，在足细胞、肾小管上皮细胞有表达。研究表明，SIRT1激活可通过抑制炎症、氧化应激、肾纤维化、细胞凋亡和促进自噬等延缓DN发展[17]。Li等[18]通过免疫共沉淀发现，TGF-β1可诱导NRK-52E细胞Smad3乙酰化水平增加。而SIRT1激活剂RSV可逆转其乙酰化水平，从而减少肾纤维化。Huang等[4]通过对5/6肾切除大鼠的研究发现，敲除SIRT1基因后，RSV的作用减弱，Smad3的乙酰化水平增加，同时TGF-β1的转录活性显著提高，加重了肾功能损害，肾纤维化表现明显，故提出SIRT1因子是保护肾脏纤维化的重要因素，且与TGF-β1/Smad3信号通路有关。本研究表明RSV干预后细胞 SIRT1表达明显上升，TGF-β1及 Smad3、Smad4表达减低，E-cad表达增高而α-SMA减低，而使用SIRT1抑制剂EX527后则无明显作用。结合上述文献及本研究结果提示，SIRT1激活后可能是通过降低Smad3/4的乙酰化水平，从而逆转EMT的发生。

三七是我国名贵药材，性甘，微苦，具有散瘀止血、消肿定痛的作用。长期的临床应用证实，三七治疗DN有较为理想的效果。PNS是三七中的主要成分，在延缓肾小管间质纤维化，改善肾功能中有明显作用。体外实验发现PNS对高糖诱导的肾系膜细胞具有保护作用，其机制是激活SIRT1，使核因子κB（nuclear factor κB,NF-κB）去乙酰化，进而抑制氧化应激和炎症反应[10]。研究表明，PNS对人肺泡上皮细胞EMT有抑制作用[19]，但具体机制尚不明确。本研究通过高糖刺激肾小管上皮细胞模拟EMT发生，使用PNS干预后，E-cad表达增加，α-SMA减少，提示PNS能够缓解EMT的发生，与上述研究结果一致。同时，TGF-β1和 Smad 表达减低，SIRT1 表达增高，而EX527抑制SIRT1的表达后，PNS作用受到抑制，由此推断PNS可能通过激活SIRT1，抑制TGF-β1/Smad通路，减少了EMT发生。

综上所述，PNS阻止高糖刺激下的肾小管上皮细胞发生EMT，其机制可能是通过诱导激活SIRT1，抑制TGF-β1/Smad通路来完成的。该研究不仅在实验上证明了PNS对肾脏的保护作用，也为其用于DN的临床治疗提供了理论依据。

参考文献：

[1] Liu Y.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(2):212-222.

[2] 王来亮,罗群.肾小管上皮间充质转化与肾脏纤维化[J].中国病理生理杂志,2014,30(10):1910-1914,1920.WANG Lailiang,LUO Qun.Renal tubular epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis[J].Chinese Journal of Pathophysiology,2014,30(10):1910-1914,1920.

[3] Kong X X,Wang R,Liu X J,et al.Function of SIRT1 in physiology[J].Biochemistry(Mosc),2009,74(7):703-708.

[4] Huang X Z,Wen D,Zhang M,et al.Sirt1 activation ameliorates renal fibrosis by inhibiting the TGF-beta/Smad3 pathway[J].J Cell Biochem,2014,115(5):996-1005.

[5] Simic P,Williams E O,Bell E L,et al.SIRT1 suppresses the epithelial-to-mesenchymal transition in cancer metastasis and organ fibrosis[J].Cell Rep,2013,3(4):1175-1186.

[6] 孙丽艳,张默涵,张红丹.三七总皂苷的药理作用研究进展[J].世界最新医学信息文摘(电子版),2016,16(82):29-30.SUN Liyan,ZHANG Mohan,ZHANG Hongdan,et al.Research progress of pharmacological action of total saponins from panax notoginseng[J].World Latest Medicine Information(Electronic Version),2016,16(82):29-30.

[7] 杜月光,柴可夫,杨明华,等.三七皂苷对糖尿病大鼠肾脏骨形成蛋白7表达的影响[J].中华中医药学刊,2009,27(2):329-332.DU Yueguang,CHAI Kefu,YANG Minghua,et al.Effects of Panax nologinoside on BMP-7 expression in kidney of diabetic rats[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2009,27(2):329-332.

[8] 杜月光,柴可夫,杨明华,等.三七皂苷对糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究[J].中国中医药科技,2010,17(1):40-41.DU Yueguang,CHAI Kefu，YANG Minghua,et al.Experimental study on the protective effect of Panax nologinoside on kidney protection in diabetic rats[J].Chinese Journal of Traditional Medical Science and Technology,2010,17(1):40-41.

[9] 吴海江,邓新娜,史永红,等.白藜芦醇对高糖刺激下人肾小管上皮细胞发生EMT的作用[J].中国细胞生物学学报,2015,32(11):1522-1527.WU Haijiang,DENG Xinna,SHI Yonghong,et al.Role of resveratrol on high glucose-induced epithelial to mesenchymal transition of human renal proximal tubular epithelial cells[J].Chinese Journal of Cell Biology,2015,32(11):1522-1527.

[10]杜月光,章科娜,姜雪儿,等.三七皂苷对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞保护作用及其机制研究[J].浙江中医药大学学报,2015,39(9):647-653.DU Yueguang,ZHANG Ke’na,JIANG Xue'er,et al.Protective effects and mechanisms of Panax nologinoside on rat mesangial cells induced by high glucose[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2015,39(9):647-653.

[11]Fan L,Sebe A,Péterfi Z,et al.Cell contact-dependent regulation of epithelial-myofibroblast transition via the rhorho kinase-phospho-myosin pathway[J].Mol Biol Cell,2007,18(3):1083-1097.

[12]Hills C E,Squires P E.TGF-beta1-induced epithelialto-mesenchymal transition and therapeutic intervention in diabetic nephropathy[J].Am J Nephrol,2010,31(1):68-74.

[13]Iwano M,Plieth D,Danoff T M,et al.Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis[J].J Clin Invest,2002,110(3):341-350.

[14]Lamouille S,Xu J,Derynck R.Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(3):178-196.

[15]Brown K A,Pietenpol J A,Moses H L.A tale of two proteins:differential roles and regulation of Smad2 and Smad3 in TGF-beta signaling[J].J Cell Biochem,2007,101(1):9-33.

[16]侯碧玉,李莉,张莉,等.SIRT1在糖尿病肾病防治中的作用[J].药学学报,2014,49(12):1625-1630.HOU Biyu,LI Li,ZHANG Li,et al.The role of SIRT1 in the treatment of diabetic nephropathy[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2014,49(12):1625-1630.

[17]Chen X F,Zhang H J,Wang H B,et al.Transforming growth factor-beta1 induces epithelial-to-mesenchymal transition in human lung cancer cells via PI3K/Akt and MEK/Erk1/2 signaling pathways[J].Mol Biol Rep,2012,39(4):3549-3556.

[18]Li J,Qu X,Ricardo S D,et al.Resveratrol inhibits renal fibrosis in the obstructed kidney:potential role in deacetylation of Smad3[J].Am J Pathol,2010,177(3):1065-1071.

[19]任周新,余海滨,李建生,等.三七总皂苷对人肺泡上皮细胞间质转化的抑制作用[J].中国中药杂志,2015,40(23):4667-4671.REN Zhouxin,YU Haibin,LI Jiansheng,et al.Inhibitory effect of Panax notoginseng saponins on alveolar epithelial to mesenchymal transition[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2015,40(23):4667-4671.