AngⅡ-ROS-PKC/Nrf2/HO-1通路调控LX-2细胞增殖的机制研究

董文珠 曹晓倩 王璐 陈杭萍 董叶娇 方佳敏 张敏 惠慧 姚立

浙江中医药大学 杭州 310053

肝纤维化是由肝组织持续慢性损伤-修复引起的细胞外基质异常沉积，从而导致肝脏组织结构和肝功能异常的一种病理过程，属于肝硬化的早期阶段。已有大量研究表明，去除损伤因素后肝纤维化是可逆的[1]。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）作为肝纤维化的主要效应细胞，合成和分泌各种细胞外基质和胶原，一直被认为是肝纤维化发生发展的中心环节[2]，抑制HSCs的活化增殖或促进HSCs的凋亡是有效减轻甚至逆转肝纤维化的关键[3]。

近年研究表明，在肝纤维化的发生发展中肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone，RAAS）起着重要的作用，RAAS存在于肝组织中并且可促进肝纤维化的形成[4]。血管紧张素Ⅱ（angiotensin，AngⅡ）通过增加机体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，合成大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），提高机体的氧化应激水平[5]。氧化应激是诸多肝脏疾病早期共同的致病因素。细胞受到氧化刺激后，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）以Ca2+依赖的形式从细胞质转位到细胞膜而被激活[6]，再以直接磷酸化的方式激活核因子相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）。Nrf2-抗氧化反应原件（antioxidant response element，ARE）是体内一条极为重要的抗氧化应激信号通路，该通路在肝脏疾病的发生、发展及预防过程中起着非常重要的作用[7]。PKC参与了Nrf2-ARE通路的激活和相关依赖基因的表达调控。PKC激活Nrf2后，Nrf2进入细胞核内与ARE结合，启动下游抗氧化保护性基因，如血红素氧化酶（hemeoxygenase-1，HO-1）基因的转录[8]。因此，Nrf2或将成为肝脏疾病治疗的新靶点，PKC-Nrf2也参与HO-1表达调控，进而发挥HO-1的抗氧化和组织保护作用[9-10]。

目前，基于PKC/Nrf2/HO-1通路来研究HSC氧化应激损伤的机制尚未见报道。本研究拟采用AngⅡ刺激人源HSC细胞系LX-2细胞，诱导氧化应激，通过检测ROS和PKC/Nrf2/HO-1通路中各蛋白的表达情况，初步揭示其调控机制，为探索肝纤维化早期的发病机制提供借鉴，藉此为从“治未病”的角度防治肝纤维化提供思路。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂 人源HSC细胞系LX-2细胞购于苏州北纳创联生物技术有限公司，胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司（批号：11011-8611），RPMI 1640 Medium Modified细胞培养基购于美国Hy－CloneTM公司（批号：SH30809.01），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购于 Vetec 公司（批号：V900090），双抗购于Gibco公司（批号：15140-122），AngⅡ购于美国 Sigma公司（批号：A9525），2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐 （2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFHDA）购于美国 Sigma公司（批号：D6883），BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（批号：P0012）、超敏ECL化学发光试剂盒Beyo Ecl Plus（批号：P0018）均购于江苏碧云天生物技术公司，HO-1兔单克隆抗体（批号：ab68477）、Nrf2 兔单克隆抗体（批号：ab62352）、PKC兔单克隆抗体（批号：ab179522）均购于abcam公司，β-Actin兔单克隆抗体（批号：#4970）、β-Tubulin兔单克隆抗体（批号：#2178）均购于Cell Signaling公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗IgG购于Jackson公司（批号：DW-GAR007）。

1.2 主要仪器和设备 扫描仪为Clinx Science instruments公司产品，酶标仪购于美国Bio-Rad公司，Guava easyCyte HT流式细胞仪购于默克化工技术（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 LX-2细胞采用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640 Medium Modified培养基，置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，隔天换液，待细胞生长至80%～90%密度时传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 MTT比色法检测LX-2细胞增殖率 取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清、不含钙离子和镁离子的培养液配成单个细胞悬液，以每孔104个细胞的数量接种至无菌96孔板内，每孔体积100μL。待细胞贴壁后，分别以10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1的 AngⅡ（DMSO 溶解）刺激细胞，筛选出最佳浓度，然后以此浓度的AngⅡ刺激LX-2细胞0～48h，每组5个复孔，于培养箱中培养。每孔分别加入用PBS溶解的MTT（5 mg·mL-1）20μL，继续孵育 4h，弃去上清液，每孔加入 150μL的DMSO，置摇床上低速震荡5min，使紫色结晶充分溶解，在酶标仪570nm处测定各孔的OD值，细胞增殖率=（OD刺激孔-OD空白孔）/（OD未刺激孔-OD空白孔）×100%。

1.3.3 流式细胞仪检测ROS的生成 采用Cai等[11]的方法，以10-5mol·L-1AngⅡ分别刺激LX-2细胞0、0.5、2、12、24、48h 后，0.25%胰酶消化收集各组细胞，PBS 液洗涤 3 遍，调整细胞浓度为（106～2×107）个/mL，按照1:1 000的比例以无血清培养液稀释荧光探针 DCFH-DA（原浓度为 10 mmol·L-1），加入各组细胞后37℃避光孵育30min。每隔3～5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。PBS洗涤3遍后过300目滤膜，流式细胞仪检测（激发波长488nm，发射波长525nm），细胞数目不少10 000个，以DCF平均荧光强度（the mean fluorescent intensity）值代表细胞内ROS的表达水平。

1.3.4 Western blot检测PKC、Nrf2及 HO-1蛋白表达情况 10-5mol·L-1AngⅡ刺激 LX-2 细胞 0、0.5、2、12、24h，收集培养皿里的细胞，每个培养皿加入100μL裂解液裂解30min，于4℃、12 000r/m离心15min，弃去上清液，提取各组总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加5×SDS上样缓冲液混匀，煮沸变性5min，制备样品。向加样孔内加入40μg蛋白样品和蛋白Marker 5μL，先 80V电泳 50min，后 100V电泳90min，结束后冰上湿法转膜100V 2h。用含5%脱脂奶粉的TBST液室温封闭1h，再以含5%脱脂奶粉的TBST 液稀释 β-Actin、β-Tubulin、PKC、Nrf2 和 HO-1兔单克隆抗体，将各PVDF膜放入相应的一抗中，4℃孵育过夜，回收一抗，TBST洗膜3次，每次10min。加入山羊抗兔二抗IgG，室温摇床孵育1.5h，回收二抗，TBST洗膜3次，每次10min，将ECL化学发光试剂显影液滴于PVDF膜，扫膜及图像分析。以目的蛋白与β-Actin蛋白及β-Tubulin蛋白灰度比值表示蛋白表达水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示。多组间均数差异性比较采用单因素方差分析；组间多重比较，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的AngⅡ作用不同时间对LX-2细胞增殖的影响 不同浓度的AngⅡ刺激LX-2细胞后，细胞增殖率均较正常组升高，但只有AngⅡ浓度为10-5mol·L-1时，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见图 1A。据此，以 10-5mol·L-1的 AngⅡ持续刺激LX-2细胞48h，观察各时间点的增殖情况。与正常组比较，接受刺激 0.5、1、2、18、24h 后，LX-2 细胞增殖率明显升高（P＜0.05，P＜0.001）。见图 1B。

图1 AngⅡ对LX-2细胞增殖的影响Fig.1 Effect of AngⅡon proliferation of LX-2 cells

2.2 AngⅡ诱导LX-2细胞对ROS的影响 根据浓度筛选结果，选择10-5mol·L-1为AngⅡ作用浓度。与正常组比较，该浓度AngⅡ刺激LX-2细胞0.5、24h后，ROS显著增加（P＜0.05）。见图 2。

2.3 AngⅡ诱导 LX-2 细胞对 PKC、Nrf2、HO-1 蛋白表达的影响 根据浓度筛选结果，选择10-5mol·L-1为AngⅡ作用浓度。与正常组比较，该浓度AngⅡ刺激LX-2细胞2、24h后，PKC蛋白表达水平显著上调（P＜0.05，P＜0.01）；该浓度 AngⅡ持续刺激 LX-2 细胞24h后，Nrf2蛋白表达水平呈时间依赖性上调，其中2、12、24h时 Nrf2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。与正常组比较，10-5mol·L-1AngⅡ持续刺激LX-2细胞后，HO-1蛋白表达水平先下降后上升，刺激24h时HO-1蛋白表达水平呈显著性上调（P＜0.05）。见图 3。

图2 AngⅡ对LX-2细胞ROS的影响Fig.2 Effect of AngⅡ on ROS of LX-2 cells within 0～48h

3 讨论

对于众多的慢性肝病患者而言，如何使肝硬化或肝纤维化逆转，是目前研究的一个热点。HSC的持续激活是肝纤维化的始动环节，激活后的HSC会产生众多细胞因子，其中包括促进肝纤维化的血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、ROS、AngⅡ等，也有抑制肝纤维化的细胞因子如一 氧 化 氮 （nitrogen monoxide，NO）、 脂 联 素（adiponectin，APN）等[12]。当损伤肝脏的因素消失后，在肝纤维化的逆转过程中，HSC也发生了凋亡，这是肝纤维化逆转的关键环节[13]。AngⅡ作为RAAS中的主要肽类激素，可诱导LX-2细胞的增殖及迁移[14]，ROS、PKC、Nrf2、HO-1 等也参与了此过程[15-16]。

图3 AngⅡ对LX-2细胞PKC、Nrf2、HO-1蛋白表达的影响Fig.3 Effect of PKC,Nrf2,HO-1 protein expression stimulated by AngⅡ(10-5mol·L-1)on LX-2 cells

一般认为，LX-2细胞在体外贴壁生长即为激活状态，但活化程度较低，为了更好地模拟肝纤维化发生时HSC的活化程度，本研究选用AngⅡ作为LX-2的激活剂[17]。采用不同浓度的AngⅡ刺激LX-2细胞，细胞增殖率升高，这与Zhang等[18]研究结果一致，但是细胞增殖率并不随AngⅡ浓度增加而增大，本研究中AngⅡ浓度为10-5mol·L-1时对细胞增殖的刺激作用强于10-4mol·L-1，可能是高浓度药液由于渗透压增高，导致LX-2细胞增殖反而降低[19]。以10-5mol·L-1AngⅡ刺激LX-2细胞后，在不同时间点检测细胞增殖情况，AngⅡ刺激0.5、18和24h时，与正常组比较，细胞增殖有统计学差异，但细胞增殖并不是随AngⅡ刺激时间延长而增多。采用荧光探针DCFH-DA标记ROS的生成并用流式细胞仪检测，提示用10-5mol·L-1AngⅡ刺激细胞0.5、24h时，与正常组比较ROS显著增加，但并不随AngⅡ刺激时间延长而增多，这与MTT结果一致。而且受ROS刺激后，PKC蛋白表达趋势也与细胞增殖趋势一致，说明细胞的增殖与ROS的生成以及细胞内PKC蛋白表达情况密切相关。

PKC-Nrf2-HO-1通路是体内极为重要的内源性抗氧化应激通路，可维持体内的氧化还原平衡，从而降低肝脏对氧化应激的敏感性。10-5mol·L-1AngⅡ持续刺激细胞24h，与正常组比较，AngⅡ刺激0.5、24h时，PKC蛋白表达水平显著上调。Nrf2蛋白表达水平呈时间依赖性增高，刺激2h时增高显著。该结果提示，AngⅡ先激活PKC，而后诱导Nrf2从复合物解离并移位入核。而HO-1蛋白表达水平在刺激24h后显著上调，这与王宁等[20]研究结果一致。Nrf2进入核内后，识别并结合ARE，继而启动下游抗氧化保护性基因HO-1的表达，减轻细胞内氧化应激水平及氧化应激所造成的细胞损伤，对细胞具有保护作用[21]。据此笔者推测，AngⅡ刺激LX-2细胞，在早期即可产生ROS，促进细胞的增殖，并迅速激活PKC；同时，被ROS活化的PKC可诱导Nrf2从复合物解离并移位入核，继而激发HO-1的表达，启动了细胞自身潜在的抗氧化作用。这是AngⅡ诱导ROS致肝纤维化的可能机制之一，该机制的揭示为从“治未病”的角度防治肝纤维化提供了新的思路。至于PKC、Nrf2在整个通路中的调控作用，笔者拟在后续的研究中采用siRNA技术沉默PKC、Nrf2的表达以进一步深入考察。

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