MMP-7、TIMP-2在食管癌组织的表达及预后关系

朱晓磊， 朱自江， 王文昊， 庞瑶， 脱广鑫

食管癌的主要治疗方式是手术治疗，术后复发和转移是外科医生关注的焦点[1-3]。肿瘤根治术后复发、转移是一个多因子参与的复杂的生物学过程，而它与肿瘤细胞与周围间质的相互作用、肿瘤细胞生物学特性以及患者自身的免疫状态和肿瘤微环境等多个因素关系密切，其过程可涉及肿瘤抑癌基因或癌基因的失活或激活，肿瘤细胞与靶器官和机体的相互作用。基质金属蛋白酶(MMP)是一种肽链内切酶，现已发现了26种MMP，称为MMP家族[4-5]。MMP家族高表达和高活性现象在所有肿瘤组织中均被发现[6-9]。组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP) 是MMP家族的特异性抑制剂，可抑制MMP家族的活动和分解活性[10-12]。MMP/TIMP是否与食管癌术后的转移和复发相关，目前尚无定论。基于此，我们通过检测MMP-7和TIMP-2在食管癌术后生存时间>5年和<1年患者中表达情况，来探讨MMP-7和TIMP-2表达量与食管癌术后复发、转移以及预后的关系。

1 资料和方法

1.1 临床资料

收集甘肃省人民医院胸外科2010年1月至2013年1月食管鳞状细胞癌(ESCC)的临床资料，筛选出生存时间>5年和<1年患者。从病理科借取纳入患者石蜡标本，此外借取同期62例正常对照标本(距食管肿瘤≥3 cm正常食管组织)。邀请2位资深病理学医生独立复习HE切片，明确病理学诊断，若诊断结果不一致，由第3位病理学医生参与确定。排除术前放化疗病例，共入组186例。分为两组：A组为生存时间>5年124例；B组为生存时间<1年且死因为食管癌复发、转移62例。A、B两组一般资料见表1。患者肿瘤大小、分化程度、有无淋巴结转移、淋巴结转移个数、根治程度、残端情况、TNM分期和病理分期，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；年龄、性别、肿瘤部位、吻合部位、术后有无放化疗和吻合方式，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 生存时间>5年(A组)和生存时间<1年(B组)患者一般资料比较(例)

1.2 组织芯片制备

186例ESCC和62例正常食管组织标本都用4%甲醛固定，再用石蜡包埋，切片厚4 μm，用HE染色并在光学显微镜下观察，ESCC癌组织选取肿瘤细胞形态完整组织，正常食管组织选取鳞状上皮，用记号笔分别进行定位，再对照相应供体蜡块进行定位和标记。载体蜡块制备：取莱卡石蜡(97.5g)+蜂蜡(2.5g)溶化后，注入35 mm×27 mm×9 mm载体蜡块模具中。设计组织微阵列：用组织芯片制备仪打孔针在载体石蜡上打出间距为1.0 mm，直径0.6～0.8 mm，深度为4 mm的孔，设计成9×7阵列。组织芯转移：用采样针获取已标记组织芯(组织芯直径为0.6～0.8 mm)，每个组织芯之间间距0.2 mm，按随机排列方法把已获取的组织芯打入载体石蜡中，左上角用一空白孔建立坐标标识)。每例ESCC标本组织取3～5个点，共844点，每例正常食管组织取3个点，共取186点，制备1 030个观测点。采用连续切片方法将载体石蜡切片，1张用HE染色，其余用3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APES，SIGMA)硅化的载玻片裱片，并置于56 ℃烤箱中烘烤48 h做IHC染色。

1.3 免疫组化

1.3.1 主要仪器与设备 见表2。

表2 主要设备和仪器

1.3.2 第一抗体来源 见表3。

1.3.3 操作步骤 MMP-7、TIMP-2用LsAB法。用二甲苯将微阵列切片脱蜡，再用梯度乙醇脱水；阻断内源性过氧化物酶，用3%过氧化氢处理切片(25 min)，再蒸馏水洗涤(摇床，5 min×2次)；抗原修复：TIMP-2用EDTA高温高压法修复，MMP-7不需要修复；0.01 mm/L PBS洗涤(摇床，5 min×2次)；血清封闭：滴加非免疫羊血清(稀释度1∶20)，用盖玻片加封置于7 ℃孵育20 min；除去盖玻片，用滤纸吸去血清；将第一抗体滴加后用盖玻片加封，置于37 ℃孵育2 h；再用0.01 mm/L PBS洗涤(摇床，5 min×2次)；滴加生物素标记羊抗鼠抗体(稀释度1∶200)检测MMP-7、TIMP-2的切片，置于37 ℃孵育45 min；再用0.01 mm/L PBS洗涤(摇床，5 min×2次)；滴加辣根过氧化物酶HRP标记链霉亲和素复合物(稀释度1∶200)，加盖玻片置于37 ℃孵育45 min；0.01 mm/L PBS洗涤(摇床，5 min×2次)；用新鲜配置DAB染色液显色，镜下观察适时终止后用自来水冲洗；用苏木素复染(室温，5 min，1%盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗返蓝15 min)；用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶进行封片。

1.4 染色结果判断

选取染色质量好的区域作为观察区，随机选择5个高倍视野，分别请2名病理科主任医师独立对染色强度作评估，由第3位病理科医生参与，最后综合结果进行评分。MMP-7、TIMP-2定位在胞质，评分标准：0分阴性(-)；1分弱阳性(+)；2分中等强度阳性(++)；3分强阳性(+++)。-～+为低表达和++～+++为高表达。

1.5 统计学方法

应用SPSS 21软件进行统计分析。A、B两组间表达强度采用秩和检验，组间阳性表达率比较采用χ2检验，各指标间以及与各临床病理特征相关性采用Spearman相关分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-7在食管癌组织中的表达情况

表3 第一抗体来源

MMP-7在食管正常鳞状上皮基底层不表达；在A组食管癌组织中呈弱阳性表达；在B组食管癌组织呈中等以上阳性表达。见图1。

图1 MMP-7在食管癌组织中的表达1A：MMP-7在食管正常鳞状上皮基底层不表达；1B：MMP-7在生存时间>5年食管癌组织中呈弱阳性表达；1C：MMP-7在生存时间<1年食管癌组织中呈中等阳性表达；1D：MMP-7在生存时间<1年食管癌组织中呈强阳性表达

2.2 食管癌组织MMP-7表达与临床病理特征的关系

MMP-7在A组中的表达强度低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。A组患者肿瘤组织MMP-7表达率为85.5%(106/124)，高表达率为27.4%(34/124)；B组肿瘤组织MMP-7表达率为93.5%(58/62)，高表达率为56.5%(35/62)，见表4。A组MMP-7高表达率低于B组，差异有统计学意义(χ2=14.930，P<0.001)。

表4 生存时间>5年(A组)和生存时间<1年(B组)MMP-7表达情况(例)

2.3 TIMP-2在食管癌组织中的表达情况

TIMP-2在食管正常鳞状上皮基底层不表达；在A组食管癌组织中呈弱阳性表达； 在B组食管癌组织中呈中等以上阳性表达。见图2。

图2 TIMP-2在食管癌组织中的表达情况2A：TIMP-2在食管正常鳞状上皮基底层不表达；2B：TIMP-2在生存时间>5年食管癌组织中呈弱阳性表达；2C：TIMP-2在生存时间<1年食管癌组织中呈中等阳性表达；2D：TIMP-2在生存时间<1年食管癌组织中呈强阳性表达

2.4 食管癌组织中TIMP-2表达与临床病理特征的关系

TIMP-2在A组中的表达强度低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。A组患者肿瘤组织TIMP-2表达率为87.1%(108/124)，高表达率为22.2%(25/124)；B组肿瘤组织TIMP-2表达率为98.3%(61/62)，高表达率为40.3%(25/62)，见表5。A组中TIMP-2高表达率低于B组，差异有统计学意义(χ2=4.014，P=0.045)。

表5 生存时间>5年(A组)和生存时间<1年(B组)TIMP-2表达情况(例)

3 讨论

恶性肿瘤细胞的浸润、复发、转移是多个因素参与的复杂的生物学过程。癌细胞诱导产生的蛋白酶具有降解细胞外基质和基底膜的能力，而此能力和癌细胞的浸润和转移密切相关。研究证实，TIMP家族是MMP家族天然抑制剂，它们在体内存在着一种动态平衡的关系，这种关系对细胞外基质和肿瘤细胞的调节起着举足轻重的作用，若平衡被破坏就会引起食管鳞状细胞癌的转移和复发。

MMP-7 是MMP家族中重要成员之一，可降解各种细胞外基质成分(层粘连蛋白、弹性蛋白、Ⅳ型胶原蛋白等)。多项研究显示，MMP-7与食管癌、胃贲门癌、非小细胞肺癌和卵巢癌等肿瘤相关，与MMP-7启动子区域多态性有关[13-17]。Shibata-Kobayashi等[18]发现，MMP-7 mRNA在食管癌表达水平高于正常食管鳞状上皮细胞。Yoshinaga等[19]报道，食管癌患者肿瘤侵及深度以及静脉受侵情况与MMP-7表达水平高低有关，同时还发现生存时间短的食管癌患者MMP-7表达阳性，生存时间长的食管癌患者MMP-7表达阴性。我们研究发现，MMP-7在A组的表达强度低于B组，A组MMP-7表达率及高表达率均低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。在分组时发现：A、B组患者肿瘤的大小、分化程度、有无淋巴结转移、淋巴结转移的个数、根治程度、残端情况、TNM分期和病理分期比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。推测MMP-7表达与食管癌术后复发、侵袭、转移有关。

食管癌的侵袭和转移是一个连续过程，多基因协同假说认为机体内抑癌基因的失活或沉默、癌基因激活或增强在癌细胞的发生、侵袭、转移的各个阶段起着不同作用，促进肿瘤发生、发展以及浸润和转移。正常情况下，体内MMP家族降解的潜能和活性都受到TIMP-2的抑制，而TIMP-2又很少受细胞因子的诱导，因此，存在着一种动态平衡[20-22]。在正常人体中，MMP-7与TIMP-2的动态平衡，保证了机体生理状态下的细胞迁移以及细胞外基质的重建，使得基底膜完整性得到保证，能很好限制肿瘤细胞的侵袭和转移，而这种平衡被打破，就可能促进肿瘤细胞侵袭和转移并影响患者的生存期[23]。本研究中，B组患者MMP-7表达强度高，表达率及高表达率均高于A组， TIMP-2亦如此。推测食管癌组织中基底膜的破坏能导致MMP-7与TIMP-2平衡打破，MMP-7高表达和过度分泌，导致TIMP-2高表达和过度分泌[24-26]。

综上所述， MMP-7/TIMP-2可作为评估食管癌术后转移和复发风险的指标。同时，可将MMP-7作为食管癌治疗的靶点。Miyazaki等[27]在结肠癌的动物模型中，用MMP-7反义寡聚核苷酸来干预MMP-7表达和阳性表达量从而干预癌细胞侵袭和转移，取得较好结果，但临床疗效尚需进一步研究。

参考文献：

[1] Varghese TK， Hofstetter WL， Rizk NP， et al. The society of thoracic surgeons guidelines on the diagnosis and staging of patients with esophageal cancer[J]. Ann Thorac Surg， 2013，96(1)：346-356.

[2] Berry MF. Esophageal cancer： staging system and guidelines for staging and treatment[J]. J Thorac Dis， 2014，6 Suppl 3：S289-297.

[3] Mao Y， He J， Gao S， et al. Controversies in the surgical treatment for esophageal carcinoma and future investigation[J]. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi， 2015，18(9)：851-854.

[4] Zeng GQ， Chen AB， Li W， et al. High MMP-1， MMP-2， and MMP-9 protein levels in osteoarthritis[J]. Genet Mol Res， 2015，14(4)：14811-14822.

[5] Ahmed HOA， Haglund C， Virolainen S， et al. MMP-7， MMP-8， and MMP-9 in oral and cutaneous squamous cell carcinomas[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol， 2015，119(4)：459-467.

[6] Vosseler S， Lederle W， Airola K， et al. Distinct progression-associated expression of tumor and stromal MMPs in HaCaT skin SCCs correlates with onset of invasion[J]. Int J Cancer， 2009，125(10)：2296-2306.

[7] Wu T， Li Y， Lu J， et al. Increased MMP-21 expression is associated with poor overall survival of patients with gastric cancer[J]. Med Oncol， 2013，30(1)：323.

[8] Shi H， Liu L， Liu LM， et al. Inhibition of tumor growth by β-elemene through downregulation of the expression of uPA， uPAR， MMP-2， and MMP-9 in a murine intraocular melanoma model[J].Melanoma Res，2015，25(1)：15-21.

[9] Shi CH， Wang WS， Zhang ZD， et al. Effect of lentivirus-mediated uPA silencing on the proliferation and apoptosis of chondrocytes and the expression of MMPs[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci， 2015，35(1)：111-116.

[10] Dossi R， Frapolli R， Di GS， et al. Antiangiogenic activity of trabectedin in myxoidliposarcoma： involvement of host TIMP-1 and TIMP-2 and tumor thrombospondin-1[J]. Int J Cancer， 2015，136(3)：721-729.

[11] Groblewska M， Siewko M， Mroczko B， et al. The role of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs) in the development of esophageal cancer[J]. Folia Histochem Cytobiol， 2012，50(1)：12-19.

[12] Ozden F， Saygin C， Uzunaslan D， et al. Expression of MMP-1， MMP-9 and TIMP-2 in prostate carcinoma and their influence on prognosis and survival[J]. J Cancer Res Clin Oncol， 2013，139(8)：1373-1382.

[13] Al-Alem LF， McCord LA， Southard RC， et al. Activation of the PKC pathway stimulates ovarian cancer cell proliferation， migration， and expression of MMP7 and MMP10[J]. Biol Reprod， 2013，89(3)：73.

[14] Zhu R， Tian Y. Astrocyte elevated gene-1 increases invasiveness of NSCLC through up-regulating MMP7[J]. Cell Physiol Biochem， 2015，37(3)：1187-1195.

[15] Safranek J， Holubec L， Topolcan O， et al. Expression of mRNA MMP-7 and mRNA TIMP-1 in non-small cell lung cancer[J]. Anticancer Res， 2007，27(4C)：2953-2956.

[16] Zhou JH， Zhang B， Kernstine KH， et al. Autoantibodies against MMP-7 as a novel diagnostic biomarker in esophageal squamous cell carcinoma[J]. World J Gastroenterol， 2011，17(10)：1373-1378.

[17] Bornschein J， Seidel T， Langner C， et al. MMP2 and MMP7 at the invasive front of gastric cancer are not associated with mTOR expression[J]. Diagn Pathol， 2015，10：212.

[18] Shibata-Kobayashi S， Yamashita H， Okuma K， et al. Correlation among 16 biological factors[p53， p21(waf1)， MIB-1 (Ki-67)， p16(INK4A)， cyclin D1， E-cadherin， Bcl-2， TNF-α， NF-κB， TGF-β， MMP-7， COX-2， EGFR， HER2/neu， ER， and HIF-1α] and clinical outcomes following curative chemoradiation therapy in 10 patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncol Lett，2013，5(3)：903-910.

[19] Yoshinaga K， Mimori K， Inoue H， et al. Activin A enhances MMP-7 activity via the transcription factor AP-1 in an esophageal squamous cell carcinoma cell line[J]. Int J Oncol， 2008，33(3)：453-459.

[20] Yu TS， Li Z， Zhao R， et al. Time-dependent Expression of MMP-2 and TIMP-2 after Rats Skeletal Muscle Contusion and Their Application to Determine Wound Age[J]. J Forensic Sci， 2016，61(2)：527-533.

[21] Kolude B， Adisa AO， Lawal AO， et al. Stoichiometric expression of MMP-2/TIMP-2 in benign and malignant tumours of the salivary gland[J]. TumourBiol， 2015，36(4)：2351-2357.

[22] Zhu W， Sun W， Zhang J T， et al. Norcantharidin enhances TIMP-2 anti-vasculogenic mimicry activity for human gallbladder cancers through downregulating MMP-2 and MT1-MMP[J]. Int J Oncol， 2015， 46(2)： 627-640.

[24] Kovatsi L， Batzios S， Nikolaou K， et al. Alterations in serum MMP and TIMP concentrations following chronic heroin abuse[J]. Toxicol Mech Methods， 2013，23(5)：377-381.

[25] Brun JL， Cortez A， Lesieur B， et al. Expression of MMP-2，-7，-9， MT1-MMP and TIMP-1 and-2 has no prognostic relevance in patients with advanced epithelial ovarian cancer[J]. Oncol Rep， 2012，27(4)：1049-1057.

[27] Miyazaki K， Koshikawa N， Hasegawa S， et al. Matrilysin as a target for chemotherapy for colon cancer： use of antisense oligonucleotides as antimetastatic agents[J]. Cancer ChemotherPharmacol， 1999，43 Suppl：S52-55.