遗传及环境因素与广东省梅州客家人结直肠癌的关系研究

常春， 李梅珠， 张赛容， 李涛

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤第2位[1]。近年来，我国结直肠癌发病率和病死率逐年增高，地区差异明显[2]。结直肠癌在广东省梅州客家人中发病率较高，资料显示，结直肠癌在1983—2007年均列住院患者恶性肿瘤第2位[3]。广东省梅州客家人有着相对特殊的遗传背景和饮食习惯，而对广东省梅州客家人的结直肠癌病因研究的报道较少。本研究结合流行病学和生物学方法，从宏观和微观来综合评价与探讨环境与基因在广东省梅州客家人中结直肠癌发病危险因素中的交互作用，以便为该人群结直肠癌的病因研究并为Ⅰ级预防提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2009年3 月至2015年7月期间在广东梅州嘉应学院医学院附属医院及梅州市人民医院经过病理诊断的结直肠癌300例为结直肠癌组，其中男215例，女85例，年龄36～81岁，平均年龄57.85岁。组织细胞学分型：中分化腺癌189例，低分化腺癌111例。临床分期均为中晚期。其近三代以上(含三代)父系和母系均为居住在梅州市辖区内的客家人。并随机抽取300名具有相同基线的体检健康者作为对照组。其中男206例，女94例，年龄32～79岁，平均年龄53.76岁。本研究通过嘉应学院医学院附属医院医学伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 问卷调查 采用统一设计的问卷调查表，由经培训的调查员以问询方式进行调查，主要内容包括：吸烟、饮酒、高脂饮食、烟熏腌制食品、高膳食纤维饮食以及居住地周围环境水源污染等项目。

1.3 基因多态性检测 抽取研究对象静脉血3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，-20 ℃保存后转-70 ℃低温保存。采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)检测3种基因SNP位点多态性。分别是：MTHFR A1298C、NQO1-609C/T以及p53 Arg72Pro基因。PCR-RFLP多次检测无法确定的结果，使用测序方法进行基因型确定。各引物序列及用于测序引物见表1。

1.4 统计学方法 全部资料用Microsoft Excel 软件建立数据库，对等位基因和基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡检验。应用SPSS 17.0 统计软件包进行统计分析。结直肠癌和各个因素关系用相关分析检验，采用多因素非条件logistic回归方法筛选影响客家人结直肠癌发生的可疑危险因素和保护性因素，计算比值比及95%CI，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1 各引物序列及测序引物

2.1 结直肠癌患者危险因素分析 单因素方差分析显示，吸烟、饮酒、高脂饮食、烟熏腌制食品、高膳食纤维饮食以及居住地周围环境水源污染与结肠癌发生有关，差异有统计学意义(均P<0.05)。吸烟、饮酒、高脂饮食、烟熏腌制食品、环境水源污染与结直肠癌发生呈正相关(OR>1)，为结直肠癌的高危因素。而高膳食纤维饮食与结直肠癌发生呈负相关(OR=0.21)，为结直肠癌的保护因素。见表2。

2.2 MTHFR A1298C基因与结直肠癌 MTHFR A1298C基因多态性位点的4种基因型AC、CC、等位基因A、C在结直肠癌组中分布频率分别为28.3%、6.7%、79.2%、20.8%，在健康对照组中分布频率分别为1.7%、5.6%、83.5%、16.5%，两组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。但基因型AA在结直肠癌组的分布频率为65.0%，在健康对照组的分布频率为72.7%，可减少结直肠癌的发病风险，差异有统计学意义(P<0.05)；而突变基因型AC+CC在结直肠癌组的分布频率为35.0%，在健康对照组的分布频率为27.3%，可增加结直肠癌的发病风险，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.3 NQO1-609基因与结直肠癌 NQO1-609基因多态性位点的基因型CC，突变基因型CT、TT在结直肠癌组的分布频率及健康对照组的分布频率，见表4。相对于NQO1-609的基因型CC，突变基因型CT、TT可增加结直肠癌的发病风险(P<0.05)，见表4。

2.4 p53Arg72Pro基因与结直肠癌 p53Arg72Pro基因多态性位点的基因型Pro/Arg、Pro/Pro在结直肠癌组中的分布频率与在健康对照组中的分布频率相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)。但基因型Arg/Arg在结直肠癌组中的分布频率高于健康对照组中的分布频率，增加结直肠癌的发病风险，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

3 讨论

表2 结直肠癌组和健康对照组结直肠癌危险因素单因素方差分析[例(%)]

表3 结直肠癌组与健康对照组MTHFR-A1298C多态性比较[例(%)]

表4 结直肠癌组与健康对照组NQO1-609多态性比较[例(%)]

表5 结直肠癌组与健康对照组p53Arg72Pro多态性比较[例(%)]

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其显著的地域分布差异是结直肠癌流行病学的突出特征，也形成了界线分布明显的高低发病区，这种特征提示环境因素在结直肠癌发生中可能起着主要作用。但在同样的环境中，只有少数人最终发展成结直肠癌，提示遗传因素在肿瘤的发病中也起着重要的作用。个体遗传差异的物质基础之一就是易感基因多态性，而单核苷酸多态是基因多态性最主要的形式，它决定了种族和个体之间的差异。

环境因素一直被国内外学者认为是结直肠癌发病的重要影响因素。大量研究表明，长期或大量吸烟、饮酒会增加患结直肠癌的危险性，且存在明显的剂量-效应关系[4]。酒本身无致癌性，但可作为致癌物的溶剂，促进致癌物进入黏膜，通过影响致癌物的吸收、代谢转化及影响机体的营养平衡而参与致癌过程。吸烟也会增加患结直肠癌的危险性，交互作用的分析表明吸烟与饮酒之间存在联合作用，比存在单一因素时危险性增加[5]。高脂饮食可促进胆汁酸的生物合成，产生高浓度的次级胆汁酸可造成DNA不可修复氧化损伤，进而引起肠黏膜细胞增生，导致肠黏膜结构和功能改变[6-7]。烟熏食品经高温分解产生多环芳烃和杂环胺类等促癌、致癌物，腌制食品由于含有大量亚硝酸盐，在体内可经I相代谢酶活化成为亚硝胺具有致癌性，而进食新鲜蔬菜含有较丰富叶酸、维生素A、维生素C能降低结直肠癌发生[8]，可能与其含有多种抗氧化剂能防止DNA氧化损伤有关。该研究还发现，居住地周围环境污染、水源污染、室内油烟污染等也可增加结直肠癌危险性。客家人具有独特的饮食习惯。客家菜又称“东江菜”，是广东菜三个流派之一，菜肴风味特点偏重，下油重，味偏咸，腌制食品突出。这种不科学饮食习惯可能会增加该人群结直肠癌的发生风险。

亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢关键酶，能催化5，10-亚甲基四氢叶酸不可逆转成5-甲基四氢叶酸，在叶酸代谢以及DNA甲基化和DNA合成修复的过程中发挥了重要作用。叶酸缺乏可能通过破坏DNA正常甲基化和基因组完整性而致癌[9]。MTHFR A1298C碱基突变使其编码MTHFR蛋白活性和血浆叶酸水平明显降低。对MTHFR基因多态性和人类肿瘤易感性进行研究发现，MTHFR基因多态性与结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤等发生相关[10-11]。Keku等[12]在对白种人的研究，Kono等[13]和Changdy等[14]在对印度人的研究中均发现，MTHFR A1298C多态性和结直肠癌易感性相关，1298CC对结直肠癌具保护效应。但另外一些研究则显示突变基因型增加结直肠癌患病风险。如El Awady等[15]在对埃及人的研究中发现，1298AC+CC基因型增加结直肠癌患病风险。Naghibalhossaini等[16]在对伊朗人的研究中也认为，A1298C突变增加结直肠癌患病风险。本研究结果显示，基因型AA在广东省梅州客家人结直肠癌组的分布频率为65.0%，在健康对照组的分布频率为72.7%，可减少结直肠癌发病风险(P<0.05)；而突变基因型AC+CC在广东省梅州客家人结直肠癌组的分布频率为35.0%，在健康对照组的分布频率为27.3%，可增加结直肠癌的发病风险(P<0.05)。

醌氧化还原酶(NQO1)是一种重要的化学致癌物代谢酶，可催化醌双电子还原的黄素酶，能对抗氧自由基作用产生抗氧化剂，在氧化应激过程中有保护细胞的功能。NQO1第6外显子的第609位核苷酸具有C/T单核苷酸多态性。该位点多态性可引起脯氨酸/丝氨酸改变，导致该酶活性下降，氧自由基生成增多，造成氧化应激反应，增加肿瘤发生的风险。已有研究发现，NQO1基因多态性与多种肿瘤(如白血病、肺癌、结直肠癌等)发生有关联。Lafuente等[17]在对英国人的研究中发现，结直肠癌患者NQO1突变基因型频率明显高于健康对照组，特别是伴Κ-ras基因突变的结直肠癌患者，NQO1突变基因型频率达20%，是健康对照组的6倍。Harth等[18]在对高加索人的研究中发现，NQO1失活伴重度吸烟者结直肠癌发病率明显增高。本研究结果显示，NQO1-609基因多态性位点的基因型CC，突变基因型CT、TT在广东省梅州客家人结直肠癌组的分布频率分别为30.7%、32.0%、37.3%，在健康对照组的分布频率分别为48.7%、32.7%、18.6%。相对于NQO1-609的基因型CC，突变基因型CT、TT可增加结直肠癌发病风险(P<0.05)。

p53基因是一种抑癌基因，参与细胞周期调控、细胞分化、细胞凋亡、DNA修复等重要生物学功能，约50%以上人类肿瘤与该基因变化有关。p53基因的第72密码子具有CGT/CCT的单核甘酸多态性，导致编码氨基酸由精氨酸(Arg)被脯氨酸(Pro)取代，Arg72Pro多态性可能调控突变型p53的功能，而Pro型蛋白调控细胞周期、诱导细胞凋亡和修复基因损伤的功能较弱，影响p53蛋白生物学功能。研究显示[19-20]，p53基因Arg72Pro多态性与多种恶性肿瘤相关。本研究结果显示， p53Arg72Pro基因多态性位点的基因型Pro/Arg、Pro/Pro在广东省梅州客家人结直肠癌组的分布频率分别为47.0%、24.0%，在健康对照组的分布频率分别为50.0%、28.7%，两者相比，差异无统计学意义(P>0.05)。但基因型Arg/Arg在结直肠癌组的分布频率为29.0%，在健康对照组的分布频率为21.3%，增加结直肠癌的发病风险(P<0.05)。

结直肠癌病因及发病机制复杂，目前认为其发生发展主要是遗传因素及环境因素相互作用的结果。结直肠癌发病具有明显的地域特性，提示环境危险因素在病因的重要作用，但遗传因素作用同样不容忽视。研究基因多态性与结直肠癌遗传性易感性的关系，有助于结直肠癌发病机制的认识和高危个体的筛选，为开展有针对性的个体化预防提供依据。通过检测与疾病相关的一组基因多态，结合一定的环境因素共同分析，才能确定高危个体，以期为肿瘤的早期诊断、预后评估及基因诊治提供可行途径。

参考文献：

[1] Klabunde CN， Lanier D， Nadel MR， et al. Colorectal cancer screening by primary care physicians： recommendations and practices， 2006-2007[J]. Am J Prev Med， 2009，37(1)：8-16.

[2] 毛旭华， 汤俊明， 乔国洪， 等. 高分辨率熔解曲线技术检测结直肠癌患者KRAS基因突变[J]. 中国肿瘤外科杂志， 2017， 9(5)： 296-299.

[3] 何艳梅， 洪珊. 2003—2007年住院前十位恶性肿瘤疾病构成分析[J]. 中国病案， 2010， 11(2)： 43-44.

[4] Koh WP， Yuan JM， van den Berg D， et al. Interaction between cyclooxygenase-2 gene polymorphism and dietary n-6 polyunsaturated fatty acids on colon cancer risk： the Singapore Chinese Health Study[J]. Br J Cancer， 2004，90(9)：1760-1764.

[5] Tan W， Wu J， Zhang X， et al. Associations of functional polymorphisms in cyclooxygenase-2 and platelet 12-lipoxygenase with risk of occurrence and advanced disease status of colorectal cancer[J]. Carcinogenesis， 2007， 28(6)： 1197-1201.

[6] Bajor A， Gillberg PG， Abrahamsson H. Bile acids： short and long term effects in the intestine[J]. Scand J Gastroenterol， 2010，45(6)：645-664.

[7] 赵波， 钟华戈， 吴卫， 等. 结直肠癌危险因素的流行病学研究进展[J].结直肠肛门外科，2013，19(3)：199-202.

[8] De Stefani E， Boffetta P， Deneo-Pellegrini H， et al. The role of vegetable and fruit consumption in the aetiology of squamous cell carcinoma of the oesophagus： a case-control study in Uruguay[J]. Int J Cancer， 2005， 116(1)： 130-135.

[9] Choi SW， Mason JB. Folate and carcinogenesis： an integrated scheme[J]. J Nutr， 2000， 130(2)： 129-132.

[10] 张艳玲， 苑晓燕， 张忠， 等. MTHFR基因多态和饮酒习惯与结直肠癌易感相关性的研究[J].中华肿瘤防治杂志，2008，15(17)：1298-1301.

[11] 朱凡， 王毓明， 张勤英. 血浆同型半胱氨酸、血清叶酸及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与结、直肠癌发病关系的研究[J].东南大学学报(医学版)，2010，29(1)：88-92.

[12] Keku T， Millikan R， Worley K， et al. 5，10-Methylenetetrahydrofolate reductase codon 677 and 1298 polymorphisms and colon cancer in African Americans and whites[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2002， 11(12)： 1611-1621.

[13] Kono S， Chen K. Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase and colorectal cancer and adenoma[J]. Cancer Sci， 2005， 96(9)： 535-542.

[14] Chandy S， Sadananda AMN， Ramachandra N， et al. Association of methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms & colorectal cancer in India[J]. Indian J Med Res， 2010，131：659-664.

[15] El Awady MK， Karim AM， Hanna LS， et al. Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms and the risk of colorectal carcinoma in a sample of Egyptian individuals[J]. Cancer Biomark， 2009， 5(6)： 233-240.

[16] Naghibalhossaini F， Mokarram P， Khalili I， et al. MTHFR C677T and A1298C variant genotypes and the risk of microsatellite instability among Iranian colorectal cancer patients[J]. Cancer Genet Cytogenet， 2010，197(2)：142-151.

[17] Lafuente MJ， Casterad X， Trias M， et al. NAD(P)H：quinone oxidoreductase-dependent risk for colorectal cancer and its association with the presence of K-ras mutations in tumors[J]. Carcinogenesis， 2000， 21(10)： 1813-1819.

[18] Harth V， Donat S， Ko Y， et al. NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 codon 609 polymorphism and its association to colorectal cancer[J]. Arch Toxicol， 2000，73(10-11)：528-531.

[19] Maas AM， Bretz AC， Mack E， et al. Targeting p73 in cancer[J]. Cancer Lett， 2013， 332(2)： 229-236.

[20] Liu Y， Qin H， Zhang Y， et al. P53 codon 72 polymorphism and colorectal cancer： a meta-analysis of epidemiological studies[J]. Hepatogastroenterology， 2011，58(112)：1926-1929.