康莱特注射液对人NK细胞功能作用研究

★ 黄挺 李小英（1.杭州市中医院 杭州 310007；.浙江中医药大学 杭州 310053）

中医学认为，薏苡仁味甘淡，性凉，主入脾、胃、肺经，具有健脾补肺、利水消肿、舒筋除痹、清热排脓之功效。现代药理研究表明，薏苡仁中含有脂肪酸及脂、多糖类化合物、氨基酸等，具有抗肿瘤，增强机体免疫，降血糖，抗炎镇痛等药理活性［1］。康莱特注射液（Kanglaite Injection，KLT）是从薏苡仁中提取、研制而成的供静、动脉直接输注的脂肪乳剂，主要成份为薏苡仁油，具有益气养阴、消癥散结的作用，临床上常联合放化疗或分子靶向药物用于治疗肺癌［2］、肝癌［3］、乳腺癌［4］、结直肠癌［5］等恶性肿瘤，具有增敏减毒，改善患者生活质量，延长生存期，提高机体免疫力的功效。

自然杀伤细胞（Nature killer cell，NK细胞）是机体固有免疫系统的效应细胞，形成了人体抗肿瘤和抗病毒感染的第一道防线［6］，其杀伤靶细胞不需要预先致敏，且不受MHC限制，是一种安全有效的广谱抗肿瘤细胞［7］。活化的NK细胞能够直接溶解主要组织相容性复合体I（MHC-I）分子缺陷的肿瘤细胞，通过释放穿孔素和颗粒酶B或抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）直接杀伤肿瘤细胞等靶细胞，还可分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ-干扰素（IFN-γ）等一系列促炎细胞因子，调节免疫反应而杀伤肿瘤细胞［8-9］。康莱特注射液对人NK细胞的作用，国内未见文献报道。因此本实验利用中药制剂康莱特注射液体外诱导培养人NK细胞，旨在探讨康莱特注射液对人NK细胞增殖活力、免疫表型及杀伤活性的影响，现将实验结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器 肺癌A549细胞株由本实验室RPMI1640培养液（内含10%FBS）培养；康莱特注射液购自浙江康莱特药业有限公司；改良型RPMI-1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；胎牛血清（FBS）购自浙江天杭生物科技有限公司；rhIL-2购自北京四环生物制药有限公司；人源化CD3单抗购自妙通（上海）生物科技有限公司；CCK-8溶液购自上海碧云天生物技术有限公司；0.25%胰蛋白酶购自加拿大invitrogen公司；荧光标记抗体PE-CD3、PE-Cy7-CD56均购自美国eBioscince公司；人外周血淋巴细胞分离液（Ficoll）购自天津市灏洋生物制品科技有限公司；ELISA试剂盒（IFN-γ，TNF-α）购自上海华雅思创生物科技有限公司；Countstar自动细胞计数仪购自上海睿钰生物科技有限公司；流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；酶标仪Multiskan FC购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 NK细胞的培养和扩增

1.2.1 外周抗凝血采集 选取健康志愿者及2016年3月—8月期间杭州市中医院肿瘤科晚期肺癌（腺癌）患者各5例，分别采集肘静脉血30mL，收集于含10mL肝素的抗凝瓶内。

1.2.2 外周血单个核细胞（PBMC）的分离 预先将人淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque（密度1.077），加入两支50mL无菌离心管，10mL每管。用生理盐水将吸取血浆后的标本还原至40mL并充分混匀，缓慢加入在Ficoll-Hypaque上，分离液和血液样本的体积比为1∶2，2000rpm离心20min，离心完毕，小心吸取白膜层的单个核细胞，加生理盐水补足40mL，2000rpm离心10min，共洗涤3次。

1.2.3 NK细胞的培养及扩增 将PBMC悬浮于NK细胞培养基（RPMI1640培养液+1000IU/mL rhIL-2+100IU/mL青-链霉素溶液），调整细胞密度为1×106/mL，接种至w/2mm细胞培养皿中，加5%自体血浆、10ng/mL CD3单抗，混匀后放置在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，此后每隔24h补加CD3单抗10ng/mL，连续添加4天。细胞培养至第6天，离心收集细胞，弃上清，用生理盐水洗涤1次，加入新鲜NK细胞培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×106/mL，接种于6孔板中，根据添加不同浓度的康莱特注射液分为A-E 5组：A组（不加康莱特），B-E组（分别加康莱特0.25、0.5、1、2μL/mL），加入相应浓度的康莱特注射液后混匀，于37℃、5%CO2培养箱中培养。此后每隔2～3天，根据细胞生长情况半量换液，并补加新鲜NK细胞培养基、5%自体血浆和相应浓度的康莱特注射液。若NK细胞扩增状况良好，可将细胞转移至T25培养瓶继续培养。

1.3 NK细胞形态及增殖能力的分析 诱导细胞培养的第7、10、15天，在倒置显微镜下观察NK细胞的形态，并用0.4%台盼蓝进行染色，通过全自动血细胞计数仪检测各组NK细胞浓度，计算细胞总数（细胞总数=培养液总体积×细胞浓度）。

1.4 流式细胞术检测各组NK细胞免疫表型

1.4.1 流式细胞仪检测体外扩增产物的制备 于NK细胞体外扩增的第15天，将各组培养瓶中的细胞吹匀后分别取2×105个细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤3次，吸取上清液，沉淀的细胞加入1mL生理盐水重悬。

1.4.2 流式抗体的标记 空白对照管中不加任何荧光抗体，向CD3单标记管中加入5µl PE-CD3荧光抗体，CD56单标记管中加入5µl PE-Cy7-CD56荧光抗体，向双标记管中同时加入5µl PE-CD3荧光抗体和5µl PE-Cy7-CD56荧光抗体，混合均匀，4℃避光静置30min，1000rpm离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤细胞2遍，弃上清，沉淀的细胞加入500μL生理盐水重悬并转移至对应的BD管中，即可使用流式细胞仪进行检测，分析CD3-CD56+细胞的百分比。

1.5 ELISA法检测各组NK细胞上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌量 收集各组体外培养至15天的NK细胞，弃上清，调整细胞密度为2×105/mL，接种于96孔板，每组设置3个平行复孔，放置在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育48h后取出，1500rpm离心5min，每孔吸取100μL细胞上清液，用ELISA法检测各组NK细胞上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌量。

1.6 CCK-8法检测NK细胞的杀伤活性

1.6.1 肺癌A549细胞的培养 将冻存的肺癌A549细胞复苏后，接种于含10%胎牛血清、1%双抗（100IU/mL青-链霉素溶液）的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育，定期更换培养液，大概有80%～90%铺满培养瓶底则可进行传代。

1.6.2 靶细胞的制备 取对数生长期的肺癌A549细胞，吸走培养液，用生理盐水清洗细胞2次，加入37℃预热的胰蛋白酶消化贴壁的A549细胞，待细胞完全脱落后，加入含10%FBS RPMI1640培养液终止消化，充分吹打细胞液，将其混匀，计数。收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用无血清RPMI1640培养液洗涤3次，调整细胞密度为1×105个/mL作为靶细胞。

1.6.3 效应细胞的制备 在各组NK细胞诱导培养的第15天，将每组培养瓶中的细胞吹匀后，计数。收集各组NK细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用无血清RPMI1640培养液洗涤2次，将NK细胞密度调整为1×106个/mL作为效应细胞。

1.6.4 CCK-8法检测各组NK细胞杀伤靶细胞的能力 取平底96孔培养板，每个样本设3个复孔，分为靶细胞组、效应细胞组和实验组，按效靶比10∶1种入效应细胞及靶细胞。其中靶细胞组、实验组提前种入靶细胞，每孔50μL，96孔板最外周一圈每孔分别加入100μL生理盐水，放置在37℃、5%CO2培养箱中孵育24h后取出，在倒置显微镜下观察每孔中靶细胞均已贴壁。吸走培养液，靶细胞组每孔加入新鲜RPMI1640培养液100μL。效应细胞组每孔加入效应细胞、RPMI1640培养液各50μL，实验组每孔加入效应细胞、RPMI1640培养液各50μL，置37℃、5%CO2培养箱中培养16-18h。每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育1-2h，终止培养，全自动酶标仪检测各孔在450nm波长处的光密度（D）值，并计算杀伤率。NK细胞杀伤活性（%）=［1-（实验孔OD值-效应细胞孔OD值）/靶细胞孔0D值］×100%

1.7 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，数据采用均数加减标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05或P＜0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NK细胞形态观察 倒置显微镜下观察NK细胞体积较小，圆形透亮，在培养基中呈悬浮生长。各组NK细胞在培养第7天开始分裂增殖，细胞生长快，数量逐渐增多，各组间差异不明显。细胞培养至第10天，A、B、C、D、E组均有细胞集落形成，但A组和B组细胞集落体积较小，集落数较少，而C、D、E组细胞集落体积较大，集落数较多，尤以D组最明显（见图1）。

2.2 培养第10天、第15天各组NK细胞增殖情况 患者样本组中各组NK细胞增殖情况显示（见表1），培养至第15天时，0.5～2μL/mL KLT组NK细胞数与不加KLT对照组比较均明显增加（P＜0.05或P＜0.01），1μL/mL KLT组NK细胞数增加最明显［（33.97±1.97）×106］。

图1 培养第10天各组NK细胞镜下形态（×400）

表1 患者样本组各组NK细胞在培养第10天和第15天的增殖情况（n=5，×106）

健康人样本组中各组NK细胞培养至第15天时，0.5～2μL/mL KLT组NK细胞数均比不加KLT对照组显著增加［（36.13±2.35）×106、（44.29±2.08）×106、（38.17±2.14）×106vs （30.32±1.76）×106，P＜0.05 或P＜0.01］。其中也以 1μL/mL KLT 组 NK细胞数增加最明显。（见表2）。

表2 健康人样本组各组NK细胞在培养第10天和第15天的增殖情况（n=5，×106）

2.3 KLT对NK细胞免疫表型的影响 患者样本组流式细胞术检测结果示，1、2μL/mL KLT组NK细胞中CD3－CD56+细胞比例较不加KLT对照组明显升高［（44.74±11.36）%、（36.95±8.37）%vs （21.71±7.64）%，P＜0.01、P＜0.05］。（见表3）。

表3 培养第15天各组NK细胞CD3－CD56＋细胞比例（%）

健康人样本组流式细胞术检测结果示，0.5～2μL/mL KLT组NK 细胞中 CD3－CD56+细胞比例显著高于不加KLT对照组［（35.13±9.33）%、（46.56±10.78）%、（38.40±8.74）% vs（22.38±8.26）%，P＜0.05或P＜0.01］。（见表 3）。

2.4 各组 NK细胞IFN-γ、TNF-α分泌水平变化 患者样本组与健康人样本组ELISA法检测结果均显示，0.5～2μL/mL KLT组NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α均高于不加KLT对照组（P＜0.05或P＜0.01），以 1μL/mL KLT组 NK 细胞分泌的IFN-γ和TNF-α最高，且与其他组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 培养第15天各组NK细胞上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌水平（pg/mL）

2.5 CCK-8法检测各组NK细胞杀伤活性结果 患者 样 本 组 在 10∶1效 靶 比 时，0.5～2μL/mL KLT组NK细胞对肺癌A549细胞的杀伤活性分别为（53.34±5.42）%、（63.54±5.50）%、（56.55±4.32）%，均明显高于不加KLT对照组［（41.81±5.66）%］（P＜0.01）。 可 见 1μL/mL KLT 组 NK 细 胞 杀 伤活性最强，与其他组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 4。

表4 培养第15天10∶1效靶比时各组NK细胞对A549细胞的杀伤率（%）

健康人样本组在10∶1效靶比时，0.5～2μL/mL KLT组NK细胞对肺癌A549细胞的杀伤活性比不加KLT对照组明显升高［（54.15±5.86）%、（64.11±3.82）%、（56.91±5.21）% vs（42.39±5.91）%］（P＜0.01），并以1μL/mL KLT组NK细胞杀伤活性最强，与其他组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

3 讨论

NK细胞是天然杀伤细胞，其在发挥抗肿瘤活性，参与免疫应答的过程中，会在免疫应答的早期，通过分泌IFN-γ和TNF-α来实现其在固有免疫应答和获得性免疫应答之间的桥梁作用。体外扩增的NK细胞在杀伤靶细胞时，同样也会分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子来调节其活化和杀伤作用。本研究发现，患者样本组和健康人样本组中，0.5～2μL/mL KLT组NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α均明显高于不加KLT对照组，并且这三组NK细胞对肺癌A549细胞的杀伤活性也显著高于对照组。其中1μL/mL KLT组NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α的量最多，对肺癌A549细胞的杀伤活性也最强，两者结果相一致。表明康莱特注射液可以通过上调NK细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平进一步提高NK细胞对肺癌A549细胞的杀伤活性。

PI3K/AKT通路广泛存在于细胞中，能够调节细胞生存、增殖和分化等多种功能，是最主要的抑制细胞凋亡的信号途径。许琳等［10］在观察汉黄芩素对NK细胞的作用研究中发现，汉黄芩素能够促进NK细胞的增殖，上调NK细胞p-Akt蛋白表达，由此认为汉黄芩素促进NK细胞的增殖可能与PI3K/AKT信号通路有关。本实验选用具有免疫调节功能的康莱特注射液加入到传统NK细胞的培养体系中进行诱导培养。结果显示：随着培养时间的延长，患者样本组和健康人样本组中，各组NK细胞增殖均升高。细胞培养第15天，与对照组比较，0.5～2μL/mL KLT组NK细胞的增殖均明显升高，1μL/mL KLT组NK细胞数增加最明显。表明康莱特注射液对NK细胞的增殖具有一定的促进作用，这可能与PI3K/AKT信号通路有关，其具体作用机制有待进一步研究。

研究表明，康莱特注射液可提高患者的细胞免疫功能，改善患者生存质量。曹向明等［11］研究中发现康莱特注射液能激活NK细胞活性，使CD4＋、CD4＋/CD8＋比例上升，促进IL-2分泌，激活巨噬细胞的吞噬能力，从而提高机体免疫力。本实验中，各组NK细胞培养第15天，患者样本组检测结果示，与对照组比较，1～2μL/mL KLT组NK细胞中CD3－CD56＋细胞比例明显升高。健康人样本组结果显示，0.5～2μL/mL KLT组NK细胞中CD3－CD56＋细胞比例明显高于对照组。表明康莱特注射液能够提高NK细胞中CD3－CD56＋细胞比例。

综上，康莱特注射液在体外实验中能够促进NK细胞的增殖，增加NK细胞CD3-CD56+细胞比例，并通过分泌更多的IFN-γ、TNF-α来提高对肺癌A549细胞的杀伤活性，以上结论可为康莱特注射液联合NK细胞治疗恶性肿瘤提供一定的实验依据。

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