康莱特注射液对人胰腺癌细胞株PANC-1增殖和凋亡影响的实验研究

康利民，郑 永，杨文雄，王阿勇，施红宁

(普洱市人民医院肝胆外科，云南 普洱 665000)



康莱特注射液对人胰腺癌细胞株PANC-1增殖和凋亡影响的实验研究

康利民，郑 永，杨文雄，王阿勇，施红宁

(普洱市人民医院肝胆外科，云南 普洱 665000)

目的 通过康莱特注射液作用于人胰腺癌细胞株PANC-1，观察其对PANC-1细胞增殖和凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。方法 倒置显微镜及电镜观察80 μL·mL-1康莱特注射液作用PANC-1细胞72 h后细胞形态改变；采用MTT比色法检测不同浓度(10、20、40、60、80、100 μL·mL-1)康莱特注射液对PANC-1细胞生长增殖抑制作用的影响；同时采用流式细胞术检测不同浓度(10、20、40、60、80、100 μL·mL-1)康莱特注射液对PANC-1细胞周期的影响。结果 细胞形态学检查发现80 μL·mL-1康莱特注射液处理PANC-1细胞72 h后细胞生长稀疏，细胞质透亮度下降，线粒体等细胞器功能障碍，细胞核功能上受到一定的抑制；不同浓度康莱特注射液作用于PANC-1细胞株不同时段(24、48、72 h)后肿瘤细胞生长受到了一定的抑制且呈现时间和剂量依赖性；不同浓度康莱特注射液处理PANC-1胰腺癌细胞72 h后PANC-1细胞周期均阻滞于G2/M期，康莱特注射液可剂量依赖性的诱导PANC-1细胞凋亡。结论 康莱特注射液能够有效抑制人胰腺癌细胞株PANC-1在体外的生长，其机制可能是通过抑制细胞增殖，促进肿瘤细胞的凋亡而实现，有望成为胰腺癌的有效治疗药物。

胰腺癌；康莱特注射液；细胞增殖；细胞凋亡

胰腺癌是肝胆外科恶性程度极高的肿瘤之一，近年来发病率有增高的趋势。胰腺癌发现时多已处于中晚期，很难完全依靠手术达到根治目的[1]。化疗作为肿瘤综合治疗的重要手段，在胰腺癌中亦发挥着重要的作用，然而目前尚缺少对胰腺癌化疗特别敏感的抗肿瘤药物。康莱特注射液是从中药薏苡仁中提取到的抗肿瘤有效成分。临床应用亦证实其在原发性肝癌、结直肠癌的治疗中显示出较好的疗效，但其在胰腺癌治疗中尚缺乏系统的基础研究。本实验通过对人胰腺癌细胞株PANC-1的体外培养，研究康莱特注射液对细胞增殖的影响，探讨其在治疗胰腺癌中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 康莱特注射液购自浙江康莱特药业有限公司；PANC-1细胞培养基、胎牛血清、青霉素链霉素双抗均购自美国Invitrogen公司；二甲基亚砜(DMSO)、MTT等其他试剂均购自美国Sigma-Aldrich公司；CO2培养箱购自德国Heraeus公司，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD生物公司；JEM-ARM200F透射电镜购自日本JEOL公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PANC-1细胞培养 PANC-1细胞购自美国ATCC细胞库，PANC-1培养在DMEM完全培养基中，培养基中包含体积分数10%胎牛血清、50 μL·mL-1青霉素和100 μL·mL-1链霉素双抗。细胞置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中，待生长良好后取对数生长期PANC-1细胞用于本研究。

1.2.2 倒置显微镜及电镜观察PANC-1细胞形态变化 取对数生长期的PANC-1肿瘤细胞，调整细胞密度接种于6孔培养板，37 ℃、体积分数5% CO2培养12 h后，加入含80 μL·mL-1康莱特注射液的DMEM培养基2 mL，继续培养72 h，倒置显微镜观察细胞形态改变；同时胰酶消化吸收细胞，丙二醛固定，柠檬酸铅染色，透射电镜观察细胞线粒体等超微结构变化。

1.2.3 MTT法检测PANC-1细胞增殖 培养后的PANC-1细胞调整密度后按照105个/孔接种于96孔培养板中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养24 h，然后分别加入含不同浓度康莱特注射液的DMEM培养基，康莱特注射液最终浓度依次为10、20、40、60、80、100 μL·mL-1。每个浓度设3个复孔，同时设阳性对照组(吉西他滨20 μmol·L-1)、阴性对照组(空白溶剂)，分别培养24、48及72 h后终止反应，每孔加入5 mg·L-1MTT 20 μL，4 h后每孔加入200 μL DMSO终止反应。490 nm波长测定每孔的吸光度(CPM)值。细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组平均CPM值/对照组平均CPM值)]×100%。

1.2.4 流式细胞术检测PANC-1细胞周期 取106个PANC-1细胞加入康莱特注射液(0、10、20、40、60、80、100 μL·mL-1)共培养72 h。4 ℃ PBS洗2遍，用体积分数0.7%冷乙醇固定细胞，4 ℃过夜，1 500 r·min-1离心去乙醇，PBS洗2遍，弃上清，0.01% RNA酶1 mL处理10 min，0.25%碘化丙啶避光染色20 min后，流式细胞仪行DNA倍体及细胞周期分析。

2 结果

2.1 康莱特注射液对PANC-1细胞形态学的影响 显微镜发现阴性对照组PANC-1细胞贴壁生长、大小形态均匀、胞体饱满成梭形；80 μL·mL-1康莱特注射液处理PANC-1细胞72 h后细胞生长密度降低及缓慢，细胞质浑浊，细胞贴壁生长数明显减少。电镜发现空白组PANC-1细胞胞膜完整、线粒体等细胞器及细胞核结构均清晰可见；80 μL·mL-1康莱特注射液处理PANC-1细胞72 h后发现细胞体积明显缩小，胞膜皱缩、细胞表面突起和微绒毛减少；细胞质明显较少、线粒体等细胞器肿胀甚至出现空泡化；同时细胞核浓缩成团，染色质不均匀聚集在细胞核膜下，呈边集现象。见图1。

2.2 康莱特注射液对PANC-1细胞增殖的影响 实验结果发现康莱特注射液对PANC-1细胞的增殖有一定程度的抑制作用，并且康莱特注射液对PANC-1细胞抑制率随着康莱特注射液浓度的增加而增加，以80、100 μL·mL-1增殖抑制作用最为显著，具有明显的量效关系；同时随着与康莱特注射液培养时间的延长，康莱特注射液对PANC-1细胞的抑制作用有显著差异(P<0.05)，100 μL·mL-1康莱特注射液共培养72 h时增殖抑制率达86.5%，具有明显的时效关系。总之，随着康莱特注射液浓度及作用时间的延长，其对PANC-1肿瘤细胞的增殖抑制作用越加明显。见表1。

2.3 康莱特注射液对PANC-1细胞细胞周期的影响 不同浓度康莱特注射液处理PANC-1细胞72 h后，随康莱特注射液浓度的增加，G0/G1期、G2/M期PANC-1细胞比例下降，S期PANC-1细胞比例增加，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，在60 μL·mL-1康莱特注射液处理PANC-1细胞72 h后，凋亡率高达41.5%；同时随着康莱特注射液浓度的增加，流式细胞图可见逐渐增强的DNA亚二倍体峰。流式细胞分析结果表明康莱特注射液可剂量依赖性的诱导PANC-1细胞凋亡并且以60 μL·mL-1康莱特注射液诱导PANC-1细胞凋亡的能力最强。见表2。

图1 康莱特注射液对PANC-1细胞形态学的影响

表1 不同浓度的康莱特注射液对不同时段PANC-1细胞增殖抑制作用

表2 不同浓度康莱特注射液对PANC-1细胞周期及细胞凋亡的影响

3 讨论

胰腺癌是临床上恶性程度极高的肿瘤，发现时多为中晚期，并失去手术机会，目前，国内5 a生存率极低，仅为1%～3%[2]。化疗是治疗晚期胰腺癌的重要方法之一。随着吉西他滨等抗肿瘤药物在胰腺癌治疗上的应用，植物提取化合物抗肿瘤药物逐渐成为了国内外的研究热点。而我国拥有悠久的传统中医药及广泛的药用植物，进一步挖掘传统中医药抗肿瘤作用及其机制值得我们深入探索研究。

康莱特注射液是从传统中药薏苡仁中提取出的有效抗肿瘤成分，是我国具有自主知识产权的中药抗肿瘤药物代表。近年来多项动物及临床研究均已证实康莱特注射液在恶性肿瘤中，特别是原发性肝癌、胃癌、结直肠癌等的治疗中有显著作用[3]。目前认为康莱特注射液能够作用于肿瘤细胞的G2/M期，从而抑制细胞的有丝分裂及生长。同时康莱特注射液能够有效促进肿瘤细胞的凋亡及抑制肿瘤血管的生成。并且康莱特注射液具有能够增强化疗患者的免疫力、减轻抗肿瘤药物的毒副反应[4]。因为康莱特注射液具有以上特点，所以目前逐渐得到临床医生的信赖和认可。

本实验细胞形态学检查发现80 μL·mL-1康莱特注射液处理PANC-1细胞72 h后细胞生长密度降低及缓慢，细胞质浑浊，细胞贴壁生长数明显减少，电镜显示细胞形态遭到破坏，线粒体等细胞器功能障碍，细胞核功能受到抑制。这些均证明康莱特注射液具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用；同时MTT实验发现100 μL·mL-1康莱特注射液与PANC-1细胞共培养72 h时增殖抑制率达86.5%，且随着康莱特注射液溶度的增加及培养实验的延长，抑制PANC-1细胞增殖的作用越明显，说明康莱特注射液对PANC-1细胞的增殖抑制作用呈现明显的浓度和时间依赖性。本实验研究结果与许健等[5]报道薏苡仁油能够明显抑制人原位胰腺癌BxPC-3细胞的增殖是一致的。

本实验流式细胞仪分析发现经康莱特注射液处理后的PANC-1细胞周期均阻滞于G2/M期，S期细胞百分比上升，特别是60 μL·mL-1康莱特注射液处理PANC-1细胞72 h后，凋亡率高达41.5%，实验结果证明康莱特注射液能够显著诱导PANC-1肿瘤细胞的凋亡。提示康莱特注射液对PANC-1肿瘤细胞生长抑制可能是通过阻滞细胞周期进而促进细胞凋亡引起的。相关研究发现康莱特注射液能够诱导包括胃癌细胞、结直肠癌细胞及肝癌细胞在内的肿瘤细胞，下调细胞凋亡抑制基因，上调凋亡诱导基因，从而起到肿瘤治疗作用[6-8]。由此推断康莱特注射液引起肿瘤细胞周期阻滞可能与凋亡基因的相关表达变化有一定的关联。

总之，康莱特注射液能够有效抑制人胰腺癌细胞株PANC-1的体外生长，提示其作用机制可能是通过抑制细胞增殖，促进肿瘤细胞的凋亡而实现，为该药物临床应用于胰腺癌的治疗提供了一定的实验依据。

[1] 舒建山,易峰涛,张帆,等.三维适形放疗联合介入化疗治疗局部晚期胰腺癌的临床观察[J].肿瘤基础与临床,2014,27(2):124-126.

[2] Mukherjee S,Hurt CN,Bridgewater J,et al.Gemcitabine-based or capecitabine-based chemoradiotherapy for locally advanced pancreatic cancer(SCALOP): a multicentre,randomised,phase 2 trial[J].Lancet Oncol,2013，14(4):317-326.

[3] 景俊杰,李小玲,南月清.康莱特注射液对肿瘤治疗的作用研究进展[J].中国药物与临床,2013,13(11):1447-1448.

[4] 姚小健.康莱特注射液联合化疗治疗老年胃癌临床观察 [J].肿瘤基础与临床,2015,28(2):160-161.

[5] 许健,沈雯,孙金权,等.薏苡仁油对人原位胰腺癌BxPC-3细胞生长及VEGF和bFGF表达的影响[J].中草药,2012,43(4):724-728.

[6] 赵娜,魏素菊,洪雷,等.康莱特注射液对吉非替尼诱导人肺腺癌A549细胞株凋亡影响的实验研究[J].临床肿瘤学杂志,2015,20(1):1-7.

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[8] 金鑫,姚良苹,卢云,等.康莱特对HepG2细胞凋亡及其Caspase-3和Survivin表达影响 [J].齐鲁医学杂志,2012,27(1):1-3.

Effects of Kanglaite Injection on the Proliferation and Apoptosis of Pancreatic Cancer PANC-1 Cells

Kang Limin,Zheng Yong,Yang Wenxiong,Wang Ayong,Shi Hongning

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,thePeople’sHospitalofPuerCity,Puer665000,China)

Objective To investigate the effects of kanglaite injection on the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer PANC-1 cells.Methods Different concentration of sodium kanglaite injection(10,20,40,60,80,100 μL·mL-1) were adder to PANC-1 cells for 24,48,72 h.Inverted microscope and electron microscope were used to observe the change of cell morphology of 80 μL·mL-1kanglaite injection of PANC-1 cells after 72 h; the MTT assay was performed to reveal the inhibitory effect on cell proliferation; cell cycle was tested by flow cytometry.Results Cell morphology examination found cell growth and sparse cytoplasm brightness decreased,mitochondria dysfunction,nuclear function was inhibited,after 80 μL·mL-1kanglaite injection treatment of PANC-1 cells of 72 h; kanglaite injection with different concentration treatment inhibited the proliferation in a dose and time-dependent manner; different concentration of kanglaite injection cocultured PANC-1 cells after 72 h,most of PANC-1 cell cycle arrested in G2/M phase,kanglaite injection could induce the apoptosis of PANC-1 cells dose dependently.Conclusion Kanglaite injection can effectively inhibit the growth of the human pancreatic cancer PANC-1 cells in vitro,and its mechanism may be through inhibition of cell proliferation,promote apoptosis of tumor cells and implementation,is expected to become the effective drugs for the treatment of pancreatic carcinoma.

pancreatic carcinoma; kanglaite injection; cell proliferation; cell apoptosis

康利民(1984-)，男，博士，主治医师，主要从事肝胆胰及微创外科基础与临床相关研究。E-mail：kanglimin2010@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.001

R735.9；R730.23

A

1673-5412(2016)05-0369-04

2015-10-22)