ApoC3基因高表达对小鼠急性胰腺炎严重程度的影响

姚瑶 林堃 庄璐 满晓华 金晶 吴洪玉 龚燕芳 纪保安 黄浩杰 李兆申

近年来高三酰甘油血症(hypertriglyceridemia,HTG)作为诱发急性胰腺炎(AP)的重要致病因素越来越受到重视。HTG型AP患者合并肝、肾、肺等其他重要脏器损伤的概率大大增加，可能导致重症急性胰腺炎，预后较差，且复发率也更高[1-3]。载脂蛋白C(apolipoprotein C,ApoC)是血浆中一种水溶性低分子量蛋白质，在脂蛋白代谢过程中发挥重要作用，其中ApoC3含量最为丰富。ApoC3高表达可抑制血管内皮细胞表面的脂蛋白酯酶活性及肝脏对富含三酰甘油的脂蛋白残体的摄取，导致HTG[4]。目前有研究[5]证明ApoC3转基因小鼠的血浆三酰甘油水平明显高于同龄野生型小鼠。本研究以ApoC3转基因小鼠建立HTG模型，采用雨蛙素腹腔注射法诱发AP，探讨ApoC3基因与血浆三酰甘油水平及AP之间的相互关系，为研究AP的发生机制提供方向。

材料与方法

一、材料与试剂

雄性C57BL/6J小鼠由第二军医大学动物实验中心提供，雄性ApoC3转基因小鼠由北京大学心血管研究所提供。所有小鼠均为8～10周龄，体重约20 g，在12 h/12 h光照周期下饲养于第二军医大学动物实验中心SPF级动物实验室，自由进食及饮水。血浆三酰甘油测定试剂盒购于北京中生北控生物科技公司。RNA Trizol提取液、Reverse Transcript试剂盒、SYBR®Green PCR试剂盒均购于TAKARA公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

二、动物分组及模型制备

12只C57BL/6J小鼠和12只ApoC3转基因小鼠均随机分为对照组及AP组，每组6只。采用腹腔注射雨蛙素50 μg/kg体重10次、每次间隔1h的方法建立小鼠AP模型，以腹腔注射生理盐水小鼠作为对照组。于第1次注射雨蛙素24 h后处死小鼠，取胰腺组织，置10%甲醛溶液固定。

三、血清三酰甘油及胆固醇水平测定

C57BL/6J和ApoC3转基因对照组小鼠在处死前行眶静脉取血，肝素抗凝，3 000 r/min离心15 min，取血清，测定血清三酰甘油及胆固醇水平，按试剂盒说明书操作。

四、胰腺组织病理学检查

取固定的胰腺组织行常规病理学检查，根据高倍镜下观察到的胰腺组织水肿、出血、坏死、炎症细胞浸润等情况评估炎症的严重程度[6]。

五、胰腺组织炎症因子表达检测

应用Trizol试剂提取胰腺组织总RNA，按RT-PCR试剂盒说明书逆转录合成cNDA，再以cNDA为模板，按照SYBR Premix EX Taq试剂盒说明书进行定量PCR扩增。IL-1β上游引物为5′-AGAGCATCCAGCTTCAAATCTC-3′，下游引物为5′-CAGTTGTCTAATGGGAACGTCA-3′；IL-6上游引物为5′-GTTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′，下游引物为5′-ATTGCCATTGCACAACTCTTT-3′；α-SMA上游引物为5′-ATGACCCAGATTATGTTTGAGACC-3′，下游引物为5′-CCAGAGTCCAGCACAATACCA-3′；TNF-α上游引物为5′-TTAGAAAGGGGATTATGGCTCA-3′，下游引物为5′-ACTCTCCCTTTGCAGAACTCAG-3′；内参RPS6上游引物为5′-GATGATGTCCGCCAGTATGTT-3′，下游引物为5′-TTGTTCTTCTTAGTGCGTTGC-3′。每个组织样本做2个复孔，通过LightCycler 480 system用最大二阶导数法的高置信度算法获得Ct值。以RPS6为对照，用相对定量分析法计算各炎症因子mRNA的相对表达量。

六、统计学处理

结 果

一、小鼠血清三酰甘油和胆固醇含量

ApoC3转基因小鼠的血清三酰甘油水平为(3.434±0.931)mmol/L，胆固醇含量为(2.553±0.178)mmol/L，明显高于C57BL/6J小鼠的三酰甘油水平[(0.766±0.120)mmol/L]及胆固醇含量[(1.996±0.08)mmol/L]，差异均有统计学意义(t=2.245，P=0.03；t=2.494，P=0.026)。

二、小鼠胰腺组织病理学表现

肉眼见对照组的C57BL/6J小鼠和ApoC3转基因小鼠胰腺均呈淡粉红色，薄片状，颜色均匀一致，光泽度好，无水肿及出血。AP组C57BL/6J小鼠胰腺呈淡粉红色，轻度水肿，稍有出血，与周围脏器部分粘连，AP组ApoC3转基因小鼠胰腺颜色晦暗，水肿明显，可见片状出血，与胰腺周围脏器有粘连。

光镜下见AP组C57BL/6J小鼠胰腺轻度水肿，局灶性腺泡细胞坏死，小叶间隙增宽，小叶间及坏死灶内有炎细胞浸润；AP组ApoC3转基因小鼠胰腺明显水肿，小叶间隙增宽、结构紊乱，腺泡细胞局限性或广泛性坏死，小叶间及坏死灶内大量炎性细胞浸润。对照组C57BL/6J和ApoC3转基因小鼠胰腺形态学结构完好，未见明显病理改变(图1)。

图1 各组小鼠胰腺组织的病理学改变(HE ×200)。1A：C57BL/6J小鼠对照组；1B：ApoC3转基因小鼠对照组；1C：C57BL/6J小鼠AP组；1D：ApoC3转基因小鼠AP组

三、小鼠胰腺组织炎症因子mRNA的表达

AP组ApoC3转基因小鼠胰腺组织IL-1β、IL-6、α-SMA mRNA表达量显著高于C57BL/6J小鼠AP组(1.72±0.07比0.78±0.09、1.58±0.09比0.87±0.04、0.83±0.05比0.44±0.04)，差异有统计学意义(P值均<0.05)，而TNF-α mRNA表达量的差异无统计学意义(0.70±0.09比0.65±0.08，P>0.05)。对照组ApoC3转基因小鼠与C57BL/6J小鼠IL-1β(0.80±0.10比0.65±0.09)、IL-6 (0.93±0.09比0.89±0.11)、TNF-α(0.76±0.09比0.69±0.10)、α-SMA(0.58±0.07比0.61±0.08)mRNA表达量差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

讨 论

HTG主要由富含三酰甘油脂蛋白(triglyceride-rich lipoproteins, TRLs)的代谢障碍引起[7]。ApoC3抑制水解TRLs的三酰甘油的脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)活性引起血浆三酰甘油水平升高[8]。近年来有研究报道该基因的变异与动脉粥样硬化、脂肪肝、糖尿病、腹主动脉瘤等HTG相关疾病的发生发展有着密切的关系[9-11]。临床重症急性胰腺炎患者通常有起病急、发病快、并发症多、死亡率高的特点，据临床统计有相当一部分患者合并HTG，但其具体发病机制尚未阐述清楚[12]。

本研究通过雨蛙素腹腔注射法构建ApoC3转基因小鼠HTG型AP，结果显示，与C57BL/6J小鼠相比，ApoC3转基因小鼠的AP病理改变更加明显，炎症因子IL-1β、IL-6 mRNA表达水平均显著升高，表明ApoC3转基因小鼠在雨蛙素诱导后发生的AP更加严重。

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