细梗香草皂苷对人胰腺癌BxPC-3细胞的体外抑制作用

于贤金 周亮 何亚红 张筱凤

以吉西他滨(gemcitabine，GEM) 为基础的化疗药物主要用于进展期或手术无法切除的胰腺癌的辅助治疗[1-3]。但GEM不能明显提高患者的生存期，且具有较为严重的细胞毒性作用[4-5]，因此研发一种新型的高效、低毒抗肿瘤药物具有重要意义。细梗香草(lysimachia capilliposide hemsl)又名排草、香排草、香草、毛柄珍珠菜, 系报春花科珍珠菜属植物。细梗香草的主要成分为皂苷(capilliposide，LC)，它有较强的抗肿瘤作用[6-7]。相关体外实验证实，LC对肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌均有生长抑制作用[8-10]，但尚未见其对胰腺癌的作用。本研究观察LC对人胰腺癌细胞株BxPC-3细胞增殖的影响，初步探究其作用机制。

材料和方法

一、细胞存活率检测

BxPC-3细胞株由上海长海医院中心实验室提供，常规培养传代。取对数生长期BxPC-3细胞，以5×103个/孔接种于96孔培养板，培养24 h后分别加入2、4、8、16、32、64 μg/ml的LC继续培养48、72 h，以不加LC的细胞作为对照组，每个浓度每个时间点设6个复孔。LC由浙江大学生物医学工程学系实验室提供。培养结束后吸弃原培养液，每孔加100 μl新培养液、20 μl MTT(美国艾美捷科技有限公司)继续培养1 h，上酶标仪测定各孔在490 nm波长处的吸光值(A490值)。细胞存活率=LC组A490值/对照组A490值×100%，以药物浓度为横坐标，绘制细胞存活率曲线，确定LC的50%抑制浓度(IC50)值。

二、细胞凋亡检测

采用流式细胞仪检测细胞凋亡。取对数生长期的BxPC-3细胞，以3×105个/孔接种于6孔板，培养24 h后每孔加入IC50的LC继续培养48 h，用不含EDTA的胰酶消化、收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次，取(1～5)×105细胞用100 μl Binding Buffer重悬，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)，轻轻混匀，室温避光反应10 min。加入400 μl Binding Buffer，混匀，在1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

三、细胞周期检测

采用流式细胞仪检测细胞周期。取对数生长期的BxPC-3细胞，以3×105个/孔接种于6孔板，培养24 h后加入IC50的LC继续培养24 h，收集细胞，以预冷的75%乙醇固定过夜，PBS缓冲液洗涤2次，弃上清液。分别加入50 μl/ml PI及100 μl/ml RNAase混匀，4℃避光反应30 min，上流式细胞仪检测细胞周期。

四、凋亡相关蛋白多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)和caspase-3表达检测

取对照组及IC50的LC培养组培养48 h的细胞，应用裂解液制备细胞匀浆。用BCA法定量蛋白后常规行蛋白质印迹法检测PARP、caspase-3蛋白表达，以β-actin为内参。兔抗人PARP一抗购自Abcom公司，工作浓度1∶1 000稀释，羊抗兔caspase-3一抗购自Abcom公司，工作浓度1∶5 000稀释，最后应用ECL化学发光，X片曝光、显影、定影。IPP6.0软件进行条带扫描，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

五、统计学处理

结 果

一、LC对BxPC-3细胞存活率的影响

8～32 μg/ml LC呈浓度依赖性抑制BxPC-3的存活，但培养48 h与72 h的细胞存活率差异无统计学意义(图1)。LC干预48、72 h后BxPC-3细胞IC50的LC浓度分别为(15.84±0.7)μg/ml、(15.17±0.76)μg/ml，故选取15 μg/ml的LC进行以下实验。

图1 LC对BxPC-3细胞存活率影响的生长曲线

二、LC对BxPC-3细胞凋亡的影响

对照组与15 μg/ml LC干预48 h组BxPC-3凋亡率分别为(1.5±0.22)%、(17.3±0.31)%，差异有统计学意义(t=-71.992,P<0.05，图2)。

图2 LC对两组BxPC-3细胞凋亡的影响

三、LC对BxPC-3细胞周期的影响

对照组与15 μg/ml LC干预24 h组BxPC-3处于G0/G1的比例分别为(44.95±2.59)%、(38.84±2.75)%；G2/M的比例分别为(6.42±1.30)%、(10.78±1.48)%；S期的比例分别为(43.63±3.84)%、(50.38±4.11)%(图3)，两组的差异均无统计学意义。

图3 LC对两组BxPC-3细胞周期的影响

四、LC对BxPC-3细胞PARP和caspase-3蛋白表达的影响

对照组、15 μg/ml LC干预48 h组的PARP蛋白相对表达量分别为1593.4±29.7、36.1±4.8；caspase-3蛋白相对表达量分别为149.1±10.2、2207.2±92.0(图4)。LC组的PARP表达显著下降，而caspase-3表达显著增加，差异均有统计学意义(t值分别为89.533、-38.505，P值均<0.05)。

图4 LC对两组BxPC-3细胞PARP和caspase-3蛋白表达的影响

讨 论

我国传统中医在肿瘤的治疗方面已取得了不少突破。中药可以直接杀伤肿瘤细胞，联合中医药治疗可减轻肿瘤患者症状，明显提高生活质量，延长生存期[11]。此外，中药与化疗伍用还具有较为显著的增效减毒、逆转肿瘤细胞耐药等作用。细梗香草皂苷已在体外实验中被证实能抑制人鼻咽癌CNE-2细胞恶性表型，并诱导其凋亡；可通过增加细胞内活性氧表达，激活线粒体凋亡途径，抑制肺癌细胞H460；能显著抑制前列腺癌、胃癌细胞增殖，其抗肿瘤作用可能与增强免疫功能和抑制肿瘤血管新生有关；还能通过抑制蛋白激酶活性，降低人非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的耐药性[8-10,12]。

细胞凋亡是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下,通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡，可维持机体内环境稳定。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族在细胞凋亡中起着重要作用。其中caspase-3是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡过程中最主要的执行者，能特异性识别、分解PARP，阻止其修复细胞受损DNA；还能裂解核纤层蛋白、凝溶胶蛋白和激动蛋白等，破坏细胞完整性，最终导致细胞凋亡[13]。本研究结果显示LC对BxPC-3细胞呈浓度依赖性显著抑制细胞的存活率，LC干预BxPC-3细胞48 h后，细胞凋亡显著增加，caspase-3表达上调，PARP蛋白表达下调，提示LC抑制BxPC-3生长的作用机制可能是通过激活caspase-3，分解PARP，抑制受损细胞的基因修复，诱导胰腺癌细胞凋亡。

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