62株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的同源性分析

何 磊，邱景富

(重庆医科大学，重庆 400016)

鲍曼不动杆菌 (Acinetobacterbaumannii，AB)属于非发酵革兰阴性球杆菌，营养要求不高，易存活于各类非生物体表面[1]，在医院各类环境中广泛存在[2-3]，尤其是各类重症监护病房(intensive care unit,ICU)。近年多次报道AB在医院内引起流行和暴发[4-6]。AB耐药形势严峻，2015年CHINET中国细菌耐药监测网数据显示，AB对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为62.00%、70.50%[7]，故耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii,CRAB)给临床防治带来极大困难，需要对其传播途径和同源性进行研究。了解传染源及传播途径，采取相应的措施有效控制AB医院流行和暴发[8]。本研究采用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)技术对中国西南某区县三级甲等医院某时段分离的CRAB进行同源性分析，结合临床资料进行流行病学分析，以期提出更精准的防控措施。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 某三甲综合医院2015年8月—2016年11月住院患者各类临床标本分离的62株CRAB，剔除同一患者长期住院或反复住院分离的重复菌株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.3 PFGE 试验 (1)挑取AB单菌落接种于营养平板，37 ℃孵育过夜，用比浊仪调整细菌悬液浓度，使浊度为3.80～4.20，加入1% Seakem Gold胶，混匀制备胶块；(2)使用含蛋白酶K细胞裂解液(CLB)消化2 h，纯水清洗胶块2次，TE(10 mmol/L Tris:1 mmol/L EDTA，pH 8.00)清洗胶块4次；(3)使用60 U ApaI(TAKARA公司)内切酶进行酶切，在37 ℃孵育4 h；(4)在CHEF-DRIII(Bio-Rad Laboratories公司)电泳仪中进行脉冲场电泳，电泳参数为5～20 s，19 h，电泳结束后，使用GelRed核酸染料染色，在凝胶成像仪中成像并保存。

1.4 PFGE分型标准 利用BioNumeric软件对图进行分析，图谱条带数量和大小相同为同一型别，3个条带以下有差异为同一型别的不同亚型，4个条带以上差异为不同型别。

2 结果

2.1 菌株来源 标本以痰为主(55份)，其余为血(4份)、支气管肺泡灌洗液(简称灌洗液，2份)和脑脊液(1份)。患者中男女性别比为1.58∶1，年龄(56±14)岁，诊断为脑卒中(34例)、慢性阻塞性肺疾病(10例)、脑外伤(10例)、多发伤(5例)、肿瘤(2例)和冠心病(1例)。

2.2 药敏结果 62株CRAB对头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星均耐药，对氨基糖苷类的庆大霉素和妥布霉素的耐药率较低，均为69.35%,对左氧氟沙星的耐药率(25.81%)最低。见表1。

表1 62株CRAB的药敏结果[株数(%)]Table 1 Antimicrobial susceptibility testing results of 62 strains of CRAB (No. of isolates[%])

2.3 PFGE结果 62株CRAB分为14个不同的型别，分别为A～N型，B、D、E、J和M型别仅包含1株菌，其中F型别包含5个亚型，A、G、H和K型别均有3个亚型，C和I型各有2个亚型。见图1、表2。

M：标准菌株，1和6为I2亚型，2和5为F1亚型，3为H1亚型，4、10、11均为G1亚型，7为K2亚型，8为B型，9为G2亚型

图1部分菌株PFGE电泳图谱
Figure1PFGE electrophoresis map of partial strains

表2 62株CRAB的PFGE分型结果Table 2 PFGE typing results of 62 CRAB strains

2.4 流行病学关联 对主要的克隆株临床资料进行分析，32株菌(占51.61%)来自ICU，另有12株菌(占19.35%)的分离患者曾入住ICU。3株F2型菌株分离时间分别为2016年4月3日(首发菌株且来源于ICU)、4月10日和4月16日，分布在ICU、神经外科和呼吸内科，且来源于非ICU的菌株分离患者均曾入住过ICU。2015年8月15日—9月7日3株G1型菌株分别来自消化内科和ICU，且3位患者均在ICU住过，2016年8月10日—11月14日分离4株菌属于G1型，首发病例在ICU入住，其余均来源于呼吸内科(其中1株分离的患者入住过ICU)。4株K3型菌株和3株L型菌株均来自ICU。见表3。

表3 主要CRAB克隆菌株的基本信息Table 3 Basic information of the main CRAB cloned strains

3 讨论

菌株同源性分析常用的方法有多位点序列分析(MLST)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)和PFGE等，其中PFGE以其重复性好、分辨力强被誉为细菌分子分型技术的“金标准”，在识别和追踪感染暴发或流行中广泛应用[17-18]。本研究菌株PFGE结果显示，62株菌分为14个不同的型别，其中5个型别只包含1株菌，存在散发菌株，与多数研究[19-24](来自临床的标本且未区分社区和医院感染，较少提及散发菌株)结果不同，但仍有部分报道提示存在散发菌株，马真[25]对138株AB进行同源性分析发现,24株散发菌株;周娇娇[26]在55株AB中发现3株散发菌株。本研究追踪了B、D、E、J和M型菌株分离患者3个月内的住院史，5名患者都在不同级别的医院住院，提示分离的AB多为外部带入，与林家福[27]分子流行病学调查结果一致，四川北部地区有2所医院存在相同基因型的CRAB。本研究调查的医院为区县级医院，在分级诊疗的政策背景下作为大型综合医院和基层医院的结合点，要接收下级医院转诊的患者，同时也要接收上级医院转回的患者，导致散发菌株较多。AB已成为一个全球化的病原体并且在不断进化[28]，虽存在外部输入的可能，但14个PFGE型别中存在多个克隆菌株且分布于多个科室，提示医院传播仍是AB流行传播的主要形式。3株F2亚型菌株分离间隔时间不超过1周，2例非ICU病例在入住ICU期间与首发ICU病例同在一个四人间进行治疗；3株K3型中的2例患者分离时间仅间隔1 d且床位相邻，另外1例患者的分离时间与首发病例相距近1个月，但其住院时间较长，与前2名患者均曾相邻，故F2型和K3型发生医院感染暴发可能性大。G1型菌株存在两次疑似暴发，第1次疑似暴发首发病例为入住过ICU的消化内科CRAB血流感染患者，仅有1例ICU患者与消化内科患者在ICU的同一四人间相对的床位入住，另1例患者入住ICU时，其他患者已转出ICU，且所在床位与消化内科患者并未在同一四人间；第2次疑似暴发首发病例为ICU病例，其余3例患者来自呼吸内科，其中1例呼吸内科患者入住过ICU且与首发病例在ICU有共同入住时间，但床位相距较远，另2例呼吸内科患者均未入住ICU，住院时间也无交集，床位也不相邻。L型3株分离间隔时间均超过1个月，住院时间无交叉，无床位聚集，不能确定为暴发。G1型和L型疑似暴发的病例并未全部在短时间内形成病例聚集，床单元聚集趋势不明显，CRAB医院传播明确，一部分亚型菌株形成暴发，另一部分亚型菌株长期存在于科室造成所住患者感染。所有暴发的首发病例均来自于ICU或者与ICU有关。存在潜在传染源的科室应对物体表面进行彻底消毒，特别是医务人员频繁接触的物体表面，如床栏杆、床旁桌、病床隔帘、门把手、护理站台面、病历夹、电话按键、电脑键盘、鼠标、呼吸机操作面板、监护仪面板、微量注射泵、输液泵等。物体表面与AB流行和暴发有较强的关联性[29-30]，在床位不紧张时实行轮换制度，对空置的病区进行消毒，经过监测合格后再重新开放。对于新发现的CRAB，一定要采取隔离措施。研究[31]表明，有效的消毒隔离措施对控制医院流行和暴发有重要作用。医务人员的手也可能成为AB的传播媒介[32]，应加强手卫生，有效控制其医院传播。本研究属于回顾性研究，无法对当时的环境或可疑物品进行采样，不能对其更详细的传播途径进行阐述，在今后研究中需要改进。

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