临床分离金黄色葡萄球菌的耐药特点和MRSA分子分型

贾 珉, 江元山, 朱建华, 高嘉嘉, 王永涛, 胡志敏, 刘志钢

(1 武汉市第一医院, 湖北 武汉 430022; 2 武汉市疾病预防控制中心, 湖北 武汉 430015)

唑的敏感率高于MSSA，差异有统计学意义(P<0.05)。皮肤软组织分离的MRSA对庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、莫西沙星、利福平的敏感率为86.90%～95.24%，而痰分离的MRSA仅为1.56%～15.63%。967株金黄色葡萄球菌检测出210株携带mecA基因，10株携带PVL基因，210株MRSA 中有8株未分型，占3.81%。MLST主要以ST 239(177株)为主；SCCmec分型主要以Ⅲ型(177株)为主；spa分型主要以t 030(177株)为主；agr分型主要以Ⅰ型(196株)为主。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是金黄色葡萄球菌获得甲氧西林抗性基因mecA而形成的，是医院感染常见病原菌之一，对临床上使用的抗菌药物常出现多重耐药，其耐药基因常位于mecA周围，和mecA偶联在一起，因而有学者将其命名为SCCmec，即葡萄球菌盒式染色体mec(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)[1]。由于SCCmec结构的不同导致不同型别的菌株耐药性和流行特点均不同，而对于不同来源的MRSA，社区获得性MRSA致病性较医院获得性MRSA强，且大部分携带杀白细胞素基因(Panton-Valentine leukocidin gene，PVL)，该基因与各种皮肤感染和坏死性肺炎关系密切。本研究对MRSA进行药敏分析及基因分型，为了解MRSA的流行病学特点及预防MRSA传播有重要意义。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 某院2014年1月—2015年11月所有住院患者检出的金黄色葡萄球菌，剔除同一患者相同部位检出的重复菌株。并将菌株来源标本分为皮肤软组织标本、痰标本和其他来源标本；其他来源标本包括血、尿、引流液(透析液、胸腔积液、腹腔积液、导管引流液和伤口脓液)。

1.2 细菌鉴定及药敏试验 金黄色葡萄球菌常规分离按照《全国临床检验操作规程》(第3版)进行，金黄色葡萄球菌的鉴定和药敏试验分别应用GP细菌鉴定卡和GP-67细菌药敏卡在Vitek 2全自动微生物分析系统上进行。药敏试验质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923、ATCC 29213；铜绿假单胞菌ATCC 27853和大肠埃希菌ATCC 25922。

1.3 细菌DNA模板制备 挑取MRSA临床分离株转入液体LB培养基中37℃摇床200 r/min振摇过夜培养，离心收集菌落，弃上清后加入TE缓冲液300 μL混悬，加入5 μL葡萄球菌溶菌酶消化细菌，37℃培养箱孵育1 h，提取细菌DNA步骤按照TIANamp Bacteria DNA Kit操作说明稍加调整进行，每个PCR反应液中分别加入1.5 μL细菌DNA洗脱液做模板进行实验。

1.4 MRSA分离株的多重PCR鉴定 采用Zhang K等[2]研究中引物对所收集MRSA进行分子鉴定，确认金黄色葡萄球菌并携带mecA抗性基因，继而鉴定其为MRSA菌株，同时进行PVL毒素基因检测。

1.5 MRSA分离株的SCCmec分型 第一套方案采用多重PCR SCCmec分型。所用引物参考Milheiriço C等[3]的研究，考虑到第一套实验方案中部分菌株带型不易确定，故第二套方案采用Kondo Y等[4]研究中引物作进一步证实，具体实验均根据文中条件进行，实验过程中确保ccr位点/mec位点和J区两个区域同时有预期PCR产物检出。SCCmec Ⅳ型亚型鉴定参考Milheiriço C等[3]研究中引物和条件进行。为了有效区别不同电泳片段，第一套方案PCR产物点样于2.0%琼脂糖凝胶中100 V电泳75 min；第二套方案PCR产物点样于1.5%琼脂糖凝胶中100 V电泳45 min。

1.6 金黄色葡萄球菌附属因子调节子(agr)分型、金黄色葡萄球菌蛋白A基因(spa)分型和多位点序列分型(MLST) 根据参考文献引物和PCR条件对MRSA菌株进行agr分型分析。根据申恩华等[5]研究中PCR反应对spaX区进行扩增，双向测序后到网站(http://www.spaserver.ridom.de/)对每条序列进行spa分型。根据Enright MC等[6]的研究，对7个管家基因进行PCR扩增，PCR产物送英骏生物有限公司进行双向测序；测序结果通过MLST数据库(http://www.nlst.net)进行MLST分析。

1.7 统计学分析 将数据导入Whonet 5.4软件进行统计分析，应用SPSS 15.0统计软件进行分析。计数资料比较采用χ2检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同标本来源MRSA检出情况 2014年1月—2015年11月共检出非重复金黄色葡萄球菌967株。标本来源分别为：皮肤软组织710株，痰94株，其他标本163株(血110株、尿16株、引流液37株)。MRSA检出210株，MRSA总检出率为21.72%；其中痰标本MRSA检出率最高，为68.09%，皮肤软组织检出率最低，为11.83%，痰和皮肤软组织标本中MRSA检出率比较，差异有统计学意义(χ2=185.23，P<0.01)。见表1。

表1 不同标本来源的MRSA检出情况(株)Table 1 Detection result of MRSA from different sources of specimens (Strain)

表2 金黄色葡萄球菌对常见抗菌药物的敏感情况Table 2 Susceptibility of S. aureus to common antimicrobial agents

-：无相关数据

2.3 不同来源标本MRSA的药敏情况 共分离MRSA 210株，其中分离自皮肤软组织84株、痰64株、其他标本62株；皮肤软组织分离MRSA对庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、莫西沙星、利福平的敏感率为86.90%～95.24%，而痰分离MRSA仅为1.56%～15.63%；但皮肤软组织分离MRSA对红霉素和克林霉素的敏感率分别为15.48%、29.76%，而痰标本分离MRSA分别为46.88%、68.75%。见表3。

2.4 MRSA分离株基因检测与分型 967株金黄色葡萄球菌检测出210株携带mecA基因，10株携带PVL基因。210株MRSA 中有8株未分型，占3.81%。MLST共有6种ST型，其中主要以ST 239(177株)、ST 59(12株)、ST 398(5株)、ST 5(5株)为主；SCCmec分型共有4型，主要以Ⅲ型(177株)、Ⅴ(10株)、Ⅳ(10株)为主；spa分型共有6型，主要以t 030(177株)、t 437(13株)、t 002(5株)、t 034(5株)为主；agr分型共有3型，其中以Ⅰ型(196株)、Ⅱ(5株)为主。见表4。

表3 不同来源标本MRSA对常见抗菌药物的敏感情况Table 3 Susceptibility of MRSA from different sources of specimens to common antimicrobial agents

表4 MRSA分离株MLST型别与SCCmec、spa、agr分型Table 4 MLST, SCCmec, spa, and agr typing of MRSA strains

3 讨论

自1961年在英国发现世界首例耐甲氧西林菌株，进而将金黄色葡萄球菌划分为MSSA和MRSA以后，MRSA逐渐成为全世界医院感染的主要病因。报道[7-8]显示，随着广谱抗菌药物的广泛应用，介入治疗、腹膜透析、静脉留置导管等技术破坏了人体正常防御机制，MRSA临床检出有下降趋势，取而代之的是耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)成为医院感染的重要病原菌。在本地区引起医院感染的葡萄球菌属细菌中是否也出现这样的趋势，有待进一步研究。本研究结果显示967株金黄色葡萄球菌中检出210株MRSA，检出率为21.72%，同时该院临床分离的73.42%金黄色葡萄球菌来源于皮肤软组织，而大多数医院金黄色葡萄球菌分离主要以呼吸道标本为主，故应根据临床症状排除污染或定植，否则会高估MRSA检出率。

从本研究的药敏结果可看出，临床所分离MRSA和MSSA均未发现对万古霉素、利奈唑胺耐药株，MRSA对9种临床常用抗菌药物的敏感率均比MSSA低，且表现为多重耐药，其中对大环内酯类的敏感率最低，糖肽类最高，这可能与抗菌药物的使用负荷和MRSA的多重耐药机制有很大的关系。

临床分离的MRSA进行SCCmec分型是区分医院感染和社区获得性感染的一个重要指标，医院获得性的MRSA菌株常常携带SCCmecⅠ～ Ⅲ型中的一种，而社区获得性MRSA或非多重耐药MRSA菌株携带SCCmecⅣ型或Ⅴ型[9-10]。由于两者对抗菌药物的敏感性及毒力存在差异，故检测SCCmec分型及耐药谱，可明确菌株分型特点及流行株，进一步结合耐药谱合理选用抗菌药物，从而有效预防与控制耐药菌株的传播和感染。本研究 210株MRSA中检出5株SCCmec Ⅱ型(2.38%)，177株SCCmec Ⅲ型(84.29%)；10株SCCmec Ⅳ型(4.76%)，10株SCCmec Ⅴ型(4.76%)；说明临床分离的MRSA菌株中以医院获得性MRSA为主。

MLST和spa分型均是基于公共数据库，对MRSA菌株特定靶基因的序列分型，有利于比较不同时间和空间的数据，发现流行克隆菌株在分子分型上的宏观变化趋势[11-12]。本研究通过spa分型共检出6种型别，其中以t 030型为主(84.29%)，表明t 030型是该MRSA主要流行的分子型别，这与全国性MRSA分子流行病学调查结论[13-14]相一致。MLST和spa分型显示，ST239-MRSA-SCCmecⅢ-t030为优势型菌株(84.29%)，其次为ST59- MRSA-SCCmecⅤ-t437(3.33%)，ST59-MRSA-SCCmecⅣ-t437(2.38%)，ST398-MRSA-SCCmecⅣ-t034(2.38%)。与孙明姣等[15]研究发现中国大陆儿童CA-MRSA 分离株以ST59克隆为主一致，但分型不同，儿童最主要的流行型是ST59-MRSA-SCCmecⅣa-t437 型，其次为ST59-MRSA-SCCmecⅤ-t437 型，考虑可能成人与儿童年龄段不同，所以导致MRSA优势型不同，需要大样本数据进一步分析。金黄色葡萄球菌的agr系统调控大约为100个基因的表达，包括毒素、代谢、转运和降解途径，根据agrD和agrC的多态性分为4个agr型的金黄色葡萄球菌。本研究中agr分型共检出3型，主要以agrⅠ型为主(93.33%)，与文献[16]报道结果相一致。

PVL是由金黄色葡萄球菌产生的细胞外毒素，大多数社区感染性MRSA携带PVL基因，因此PVL阳性可以间接证实为社区获得性感染[17]。PVL由两种蛋白质组成，即S和F蛋白(LukS-PV，LukF-PV)，两种组分各有不同的生物活性和功能，对人体的多核白细胞(PMNs)和巨噬细胞具有高度的特异性，是一种致病性蛋白，与各种皮肤感染和严重的坏死性肺炎密切相关。目前5种主要的PVL 阳性CA-MRSA克隆菌株(ST1、ST8、ST30、ST59、ST80)已经散布全世界[18]。本研究共发现PVL基因阳性菌株10株，占MRSA 4.76%，分型多为ST398-MRSA-SCCmecⅣ-t034，标本主要来源于皮肤感染，与报道中PVL的型别分析相一致。ST398从遗传背景获得PVL，向社区中个体的传播，会导致严重的医疗问题，因此，监测和限制这一克隆的传播尤为重要。

[1] Walkey AJ, O'Donnell MR, Wiener RS．Linezolid vs glycopeptide antibiotics for the treatment of suspected methicillin-resistantStaphylococcusaureusnosocomial pneumonia: a meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Chest, 2011, 139(5): 1148-1155.

[2] Zhang K, McClure JA, Elsayed S, et al. Novel multiplex PCR assay for simultaneous identification of community-associated methicillin-resistantStaphylococcusaureusstrains USA300 and USA400 and detection ofmecA and Panton-Valentine leukocidin genes, with discrimination ofStaphylococcusaureusfrom coagulase-negative staphylococci[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(3): 1118-1122.

[3] Milheiriço C, Oliveira DC, de Lencastre H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment ofmecelement types inStaphylococcusaureus[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(9): 3374-3377.

[4] Kondo Y, Ito T, Ma XX, et al. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(1): 264-274.

[5] 申恩华, 王立红, 王辉, 等.中国15个地区分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因分型研究[J].中华流行病学杂志, 2010, 31(3):308-311.

[6] Enright MC, Day NP, Davies CE, et al. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones ofStaphylococcusaureus[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(3): 1008-1015.

[7] 林金兰, 李六亿.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌医院感染及社区感染的流行特点[J].中华医院感染学杂志, 2011, 21(12):2604-2606.

[8] Barrios López M, Gómez González C, Orellana Má, et al.Staphylococcusaureusabscesses: methicillin-resistance or Panton-Valentine leukocidin presence?[J]. Arch Dis Child, 2013, 98(8): 608-610．

[9] 战晓微, 郑秋月.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及SCCmec基因分型研究[J].国际检验医学杂志, 2014, 35(18):2512-2514.

[10] 周义正, 王昌富, 李艳.荆州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子型别及相关临床特征[J].中华临床感染病杂志, 2016, 9(1):45-51.

[11] 邹自英, 韩黎, 熊杰, 等.金黄色葡萄球菌临床分离株spa分型和耐药特征研究[J].中国感染与化疗杂志, 2014, 14(2):142-145.

[12] 杨延成, 程航, 周人杰, 等.SCCmec遗传元件及其在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型中的应用[J].遗传, 2015, 37(5):442-451.

[13] 朱佩琼, 蒋琰, 王燕飞, 等.浙江省耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型及耐药性分析[J].中华临床感染病杂志, 2014, 7(4):301-305.

[14] 马晓波, 侯舒毅, 徐和平, 等.医院感染甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的 SCCmec分型及同源性研究[J].中国感染与化疗杂志, 2014, 14(3):182-185.

[15] 孙明姣, 王丽娟，刘颖超, 等.儿童社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌皮肤软组织感染临床分离株的分子特征及耐药性研究[J].中国感染与化疗杂志, 2013, 13(1):19-24.

[16] 裴双, 苏建荣.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性变迁及SCCmec基因分型[J].临床和实验医学杂志, 2015, 14(6):462-466.

[17] 刘彩林, 陈中举, 孙自镛, 等.杀白细胞素基因阳性MRSA的流行性及分子生物学特征[J].中华检验医学杂志, 2013, 36(11):1038-1041.

[18] 来俊, 孙爱华, 张传领.杀白细胞素基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染及分子特征[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2017, 37(4):269-274.