H4 亚型和N2 亚型禽流感病毒二重RT-PCR 检测方法的建立

2020-01-08

中国动物检疫 2020年1期

（广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

关键字：禽流感病毒；H4 亚型；N2 亚型；二重RT-PCR；检测方法

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）属正黏病毒科A 型流感病毒属，为分节段、单股负链RNA 病毒。根据 AIV 血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性不同，目前已发现18 个HA 亚型（H1—H18）和11 个 NA 亚型（N1—N11）[1-2]。根据致病性不同，这些亚型分为高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV），其中部分H5 和H7 亚型AIV 属于HPAIV，其余均为LPAIV。

H4 亚型AIV 属于LPAIV，能感染各类家禽及野鸟，还可跨种传播，感染哺乳动物[3]，在AIV流行调查中分离率较高。该型AIV 常分离到的亚型组合是H4N2。因此，建立一种同时鉴定H4 亚型和N2 亚型AIV 的检测方法十分必要。

诊断H4 亚型和N2 亚型AIV 的传统方法主要是病毒分离鉴定：将采集的咽喉和泄殖腔棉拭子或组织样品接种SPF 鸡胚增殖病毒96～120 h；收集鸡胚尿囊液进行血凝试验（HA），对HA 阳性样品进行血凝抑制试验（HI），鉴定H 亚型；通过PCR 扩增NA 基因并克隆测序鉴定N 亚型。该方法虽然结果准确可靠，但耗时较长、操作繁琐，在实际应用中有一定的局限性。多重RT-PCR 是在普通PCR 基础上建立的多基因检测体系，可同时检测多个靶基因或片段，具有省时省力的优点，已被广泛应用于病原体检测[4-6]。本研究旨在建立一种同时鉴别H4 亚型和N2 亚型AIV 的二重RTPCR 检测方法，为H4N2 亚型、H4 亚型和N2 亚型AIV 的快速诊断提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、血清和毒株

DNA/RNA 共提试剂盒，购自北京天根生物技术公司；AMV 反转录酶、dNTP 等反转录试剂、2×TaqPCR Mix 和pMD 18-T 克隆载体，购自TaKaRa 公司；SPF 鸡胚，购自北京梅里亚公司。H1、H3、H4、H6、H9 亚型AIV 抗血清，由广西壮族自治区兽医研究所制备保存。本研究所用毒株信息详见表1。

表1 所用毒株信息

1.2 引物设计与合成

下载GenBank 基因库中H4 亚型AIV HA 基因、N2 亚型AIV NA 基因序列，用DNAstar 软件比对序列，在保守区域，用引物设计软件Primer Premier 5.0 设计和筛选引物，经NCBI-blast 验证，最终得到2 对特异性引物，分别用于H4 亚型和N2 亚型AIV 检测。引物信息详见表2，序列送至Invitrogen 公司合成。

表2 H4 和N2 亚型AIV 引物信息

1.3 核酸提取与反转录

参照DNA/RNA 共提试剂盒说明书，抽提病毒RNA 以及传染性喉气管炎病毒（ILTV）和血清4 型禽腺病毒（FAdV4）的DNA。参照反转录体系，将RNA 反转录为cDNA，并保存在-30 ℃，备用。

1.4 条件优化

对H4 亚型和N2 亚型的引物终浓度，在0.1～1.0 μmol/L 范围内进行优化，确定2 对引物同时使用时的最佳浓度；在50～60 ℃范围内依次进行温度递增，确定最佳退火温度。

1.5 特异性试验

用优化好的二重RT-PCR 反应体系，分别对不同亚型AIV（H4N2、H1N1、H1N2、H3N2、H3N6、H3N8、H4N6、H5N2、H6N2、H6N6、H7N2、H9N2）、新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、ILTV 和FAdV4 的cDNA/DNA 模板进行检测，检验该法的特异性。

1.6 敏感性试验

参照HA 和NA 基因全长引物[7]，以H4N2 亚型AIV 为模板进行RT-PCR，将HA 和NA 基因的PCR 产物分别连接至pMD 18-T 克隆载体，转化至大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行PCR 鉴定，并将阳性重组菌送至Invitrogen 公司测序。以H4 和N2 测序正确的阳性重组菌为模板提取质粒，测定质粒浓度，并倍比稀释至108～101拷贝/μL。以不同梯度的质粒为模板，用建立的方法分别进行检测。

1.7 临床样品检测

用该法对广西南宁市活禽市场采集的152 份棉拭子样品（同只活禽的咽喉和泄殖腔拭子为1 份）进行检测。同时，将上述棉拭子样品接种9 日龄SPF 鸡胚增殖病毒，收集24～120 h 内的鸡胚尿囊液进行HA 试验；对HA 阳性的分离液，用常见AIV 亚型（H1、H3、H4、H6、H9）抗血清进行HI 试验，确定H 亚型。参照文献[7]，对已确定为H 亚型的样品，用NA 基因全长引物对其进行PCR扩增、克隆和测序，确定N 亚型。

2 结果与分析

2.1 最佳反应条件

经引物浓度和退火温度优化，确定最佳反应体系（25 μL）为：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，H4和N2 亚型上下游引物（25 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2.0 μL，加dH2O 至25 μL；最佳反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 个循环；72 ℃ 延伸10 min，12 ℃结束。

2.2 特异性试验

特异性结果见图1。该法对H4N2 亚型AIV 扩增出322 bp（H4 亚型）和224 bp（N2 亚型）两个目的条带；对H4N6 亚型AIV 扩增出322 bp 的目的条带（H4 亚型）；对H1N2、H3N2、H5N2、H6N2、H7N2、H9N2 均扩增出224 bp 的目的条带（N2 亚型）；对其他亚型AIV（H1N1、H3N6、H3N8 和H6N6）、NDV、IBV、ILTV 和FAdV4均无扩增条带，表明无交叉反应。

图1 二重RT-PCR 特异性试验结果

2.3 敏感性试验

敏感性结果见图2。该法对H4 亚型和N2 亚型AIV 108～105拷贝/μL 质粒的检测，均有明显的条带；对104拷贝/μL 质粒的检测，H4 亚型AIV仍有较亮的条带，N2 亚型目的条带较弱，但仍能检测到；对103拷贝/μL 的检测，H4 亚型和N2 亚型均检测不到，无目的条带。该法最低检测到104拷贝/μL 的H4 亚型和N2 亚型AIV。

2.4 临床样品检测

用该法检测152 份活禽棉拭子样品，检出H4亚型AIV 5 份、N2 亚型AIV 9 份，与病毒分离鉴定结果一致。

图2 二重RT-PCR 敏感性试验结果

3 讨论

H4 亚型AIV 于1956 年首次被分离到，然后频繁在亚洲、欧洲和北美洲的家禽和野鸟流行调查中被检测到[8-11]。H4 亚型AIV 宿主范围较广，包括鸡、火鸡、水禽、滨鸟、鹦鹉、海狮、马和猪等，但水禽和滨鸟是其主要宿主[12-13]。H4 亚型是常分离到的AIV 亚型之一，已有多种基因型在我国中部、东部和南部活禽市场被分离到，并且与其他亚型发生了复杂的基因重组[14-16]，因此其在流感病毒进化中的作用不容忽视[17]。虽然尚未有H4 亚型AIV 致人死亡和导致家禽大规模死亡的案例，但流行调查结果提示，需要定期监测该亚型的流行态势和遗传进化情况。N2 亚型也是常被分离到的AIV 亚型之一，常见的组合有H1N2、H3N2、H4N2、H6N2 和H9N2 等。在H4 亚型AIV 感染中，H4N2 亚型组合较普遍，因此有效检测H4 亚型和N2 亚型AIV 的方法，对禽流感早期预警和防控十分关键。所以，本研究建立了同时鉴定H4 亚型和N2 亚型AIV 的检测方法，以期为禽流感的有效防控提供技术支撑。

多重PCR 可同时扩增出2 个以上的目的片段，能同时检测不同病原体的目的基因。而引物设计是多重PCR 技术的关键。由于在同一个反应体系中使用多对引物，在扩增中可能存在竞争，因此在设计筛选引物时，需考虑以下几个因素：（1）引物之间会不会相互结合而产生非特异性扩增或引物二聚体，导致检测不准确或扩增效率降低；（2）多对引物目的片段大小要间隔100 bp 以上，只有这样才能用琼脂糖凝胶电泳区分开；（3）多对引物的退火温度需接近，以确保各扩增产物量相对平衡。