广州市ICU环境中耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的克隆相关性

林云万，周 勇，张 旭，李晓宁，赵正阳，刘 远

(广州市疾病预防控制中心，广东 广州 510440)

鲍曼不动杆菌是引起医院感染的重要致病菌，可引起包括败血症、肺炎、脑膜炎、心内膜炎、创口感染和尿路感染等在内的多种医院感染。随着广谱抗菌药物的广泛使用，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)已经在全球流行,给临床医生抗感染治疗带来严峻挑战。重症监护病房(intensive care unit，ICU)患者多重耐药菌感染已成为医院感染控制工作的重点。由于感染患者或定植者可将病原菌，尤其是多重耐药菌经多个途径排出体外，污染其居住或活动的周围环境。若日常的清洁与消毒不到位，残留的病原体可以在环境表面长期存活，并通过直接接触污染的表面或借助医务人员的手，在医院内传播[1]。环境表面是病原体的储藏库，鲍曼不动杆菌在医院环境中流行情况和流行方式还不清晰，本研究对广州市ICU环境中分离的CRAB进行碳青霉烯酶OXA基因检测，并通过脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对环境分离株进行克隆相关性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 2013年3—7月采集广州市7所医院(医院规模为600～2 200床位)ICU环境样本和医务人员手样本共156份，从其中7所医院ICU分离鉴定出39株CRAB。

1.1.2 主要仪器 VITEK 2 Compact微生物分析系统及配套的细菌鉴定卡、Bio-rad 脉冲场凝胶电泳仪、Bio-rad紫外线投射凝胶成像系统、Bio-rad PCR仪。

1.1.3 主要试剂 PFGE专用琼脂糖凝胶、限制性内切酶ApaI和XbaI、TadDNA聚合酶等生化试剂为宝生物工程(大连)有限公司产品；碳青霉烯酶OXA基因的特异性引物参照文献[2-3]合成，7个管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD的特异性引物采用鲍曼不动杆菌MLST数据库的推荐引物(http://pubmlst.org/abaumannii/info/primers.shtml),均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。药敏试验所用抗菌药物为法国生物梅里埃公司生产。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 选取ICU患者或医务人员手接触频繁的物体表面，如气管插管、床栏、仪器按钮等，将无菌棉签蘸取中和剂后采用涂抹法采集样本；医生、护士手采用涂抹法采集样本；采用空气采集器采集ICU大厅和隔离病房空气样本于磷酸盐缓冲液中。

1.2.2 细菌鉴定和药敏试验 细菌培养按照临床微生物学检验规定的常规试验操作进行，使用梅里埃VITEK 2全自动微生物分析仪鉴定出鲍曼/醋酸钙不动杆菌复合体，并通过16S-23S rRNA间区扩增片段的比对，进一步鉴定出鲍曼不动杆菌。采用K-B法检测鲍曼不动杆菌对常见药物的敏感性，药敏结果判读标准依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)2015年标准。大肠埃希菌ATCC 25922为质控菌株。对亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌可判定为CRAB。

1.2.3 碳青霉烯酶OXA基因检测 采用煮沸法提取细菌DNA，应用聚合酶链反应(PCR)技术检测OXA基因，具体操作参照试剂盒说明，扩增产物经100V恒压、1%琼脂糖凝胶电泳后观察扩增条带。

1.2.4 PFGE分型 菌悬浮液经琼脂糖凝胶包被、蛋白酶K消化和限制性内切酶ApaI酶切后，用1%琼脂糖凝胶、电压6 V/cm进行电泳，EB染色后成像。PFGE结果按美国疾病控制与预防中心Tenover等[4]推荐的方法判读，图谱完全一致定为同一型，有1～3个条带不同者为同一型的不同亚型，差异3个条带以上者为另一型。

1.2.5 MLST PCR反应体系参照试剂盒说明。纯化后的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序，利用DNA star软件对测序结果进行序列校正、拼接。测序结果提交至Genbank,将7个管家基因序列与鲍曼不动杆菌MLST数据库上相应的等位基因进行比对分析，获得每个等位基因的数值，然后将每株细菌按照gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD的顺序排列成等位基因谱，对每株细菌进行序列分型。

2 结果

2.1 CRAB来源 7所医院ICU环境和医务人员标本分离CRAB情况见表1。

2.2 药敏结果 39株环境分离的CRAB均表现为多重耐药，耐药情况见表2。

2.3 碳青霉烯酶基因检测结果 39株(100%)CRAB均携带OXA-51基因，37株(94.9%)携带OXA-23基因,OXA-24、OXA-58基因均未检出。

2.4 PFGE分型结果 运用PFGE方法对39株CRAB的克隆多态性进行分析，结果显示其中38株CRAB可分为5个型，包括A型28株，B型4株，C、D、E型各2株，另有1株为偶发株。见图1。

表1 7所医院ICU医务人员和环境标本CRAB分离情况Table 1 Isolation of CRAB from health care workers and environmental specimens in ICUs of 7 hospitals

2.5 MLST结果 7个管家基因的PCR扩增结果经测序比对后显示，39株CRAB的gltA等位基因位点相同，为1；gyrB、gdhB、recA、cpn60、rpoD各有2个等位基因位点，分别为3和15、3和2、2和28、2和61、3和32；每个ST型的gpi各有1个等位基因位点，分别为96、154、59、16、153、107、97、140。39株CRAB分为8个ST型，其中ST195共19株，占48.7%；ST829共5株，占12.8%；ST365和ST136各有4株，ST457共3株，ST229共2株，ST208和ST17各1株。见表3。

图1 39株CRAB的PFGE聚类分析结果Figure 1 PFGE cluster analysis of 39 strains of CRAB

表2 39株CRAB环境株对抗菌药物的耐药率(%)Table 2 Antimicrobial resistance rates of 39 CRAB strains from environment(%)

表3 39株CRAB等位基因型及ST型分型结果Table 3 Allele types and sequence types of 39 strains of CRAB

3 讨论

鲍曼不动杆菌生存能力强，可在环境表面长期定植，是ICU医院获得性感染的主要致病菌。侯铁英等[5]发现，鲍曼不动杆菌在感染患者和环境间存在相互传播。对ICU环境中CRAB进行分子分型研究，有利于我们了解其流行情况和流行方式，从而指导我们对CRAB感染的预防和控制。

碳青霉烯类抗生素对鲍曼不动杆菌有较好的抗菌活性，是治疗其重症感染的首选药物。鲍曼不动杆菌一旦对碳青霉烯类抗生素耐药，将给临床抗感染治疗带来严峻挑战[6]。中国耐药监测网显示，2004—2014年鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药率从13.3%上升至70.5%，泛耐药鲍曼不动杆菌检出率从 11.1%上升至 60.4%[7]。本研究中收集的CRAB来源于ICU环境，所有菌株均表现为多重耐药，部分甚至出现泛耐药，与国内报道[8]的临床分离株耐药情况基本一致。

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要是由于产碳青霉烯酶、主动外排系统、膜孔蛋白的缺失和青霉素结合蛋白的改变等，其中最主要的原因为产碳青霉烯酶。碳青霉烯酶包括Ambler分类的A、B和D类，不动杆菌属细菌以D类酶(OXA型)为主，根据氨基酸序列的同源性可将鲍曼不动杆菌的D类苯唑西林酶分为OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58[9]。OXA-23是全球流行最广泛的碳青霉烯酶,且产OXA-23的鲍曼不动杆菌是引起医院感染暴发的主要病原菌[10]。国内报道较多的也为D类的OXA-23。OXA-51型基因被认为是鲍曼不动杆菌天然固有的碳青霉烯酶基因，OXA-51型碳青霉烯酶除了水解青霉素，也能水解碳青霉烯类抗生素，但作用非常弱。在鲍曼不动杆菌鉴定时，PCR检测OXA-51基因作为一种新方法可以缩短鉴定时间[11]。本组39株CRAB，100%携带OXA-51基因，94.9%携带OXA-23基因，未发现OXA-24和OXA-58基因。可见，广州地区ICU环境中的CRAB可能主要是由OXA-23基因编码产生的碳青霉烯酶引起。

PFGE技术被认为是细菌分子流行病学分析的“金标准”。通过该方法可将38株CRAB分为5个克隆(90%以上的相似性),另有一株为偶发菌株。其中A克隆有28株菌，来自5所三级甲等医院ICU，此5所医院分布于海珠、天河、白云三个区，区域跨度大，皆处于人口稠密地段，提示广州地区ICU 环境可能存在较大范围的A克隆CRAB定植；此5所医院ICU采样时间分布在4～7月，其中，4月份采样的E医院有2株，5月份的F、G和H医院分别有8、5和5株，7月份的J医院有8株，整体上CRAB分离株数量呈增长趋势，此时间段广州气候由潮湿多雨过渡到干燥炎热，A克隆CRAB在ICU环境中的定植是否与气候变化存在联系，有待进一步研究。此外，B克隆4株菌来自越秀区的另一所医院，说明广州地区ICU环境主要流行A克隆CRAB外，也存在小范围的其他克隆群的定植情况。

1998年Maiden等[12]提出的MLST技术，能较好的发现细菌的变异信息，国际上已有大型公共数据库网站可供结果比对。39株CRAB共分为8个ST型，其中ST195占48.7%，为主要流行型别，该型分布于5间医院的ICU环境中，主要定植于床单元的高频接触物品表面。此外，通过克隆复合体的分析发现，除了ST229外，其余7个ST型均属于同一个克隆复合体CC92。CC92是世界上分布最广泛的鲍曼不动杆菌克隆复合体，其祖先为ST92。目前，诸如ST195、ST208、ST75等ST92的单基因变异型(SLVs)已成为我国某些地方特有的基因型[13-14]。有文献[15-16]报道,广州市医院临床分离的鲍曼不动杆菌ST型主要为ST195、ST136和ST208，与本研究7所医院ICU环境中分离的耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌ST型的主要分布具有相似性。

在我国，许多流行病学研究已经证实CC92克隆复合体高频率携带OXA-23基因[14-15]。最近有文献[17]报道，广州某2所医院ICU存在ST195(CC92)菌株的感染传播，菌株皆携带OXA-23基因。本研究中,ICU环境中CRAB的主要型别ST195均携带OXA-23基因，与前面的临床分离株结果相同。同时，PFGE分型的主要型别A克隆也均携带OXA-23基因。

本研究同时应用PFGE和MLST方法对CRAB菌株进行了分子分型，均得到了一个主要的流行克隆，分别为克隆A和ST195。ST195菌株绝大部分属于克隆A，而MLST将克隆A分成5个ST型。J医院的8株CRAB皆属于A克隆，而通过MLST技术可分成ST365、ST195和ST457，究其原因，可能是CRAB在繁殖或进化过程中发生碱基突变、重组等变异，该变异正好发生在用于MLST分型的7个管家基因中的某一个或几个基因的某些位点。PFGE通过脉冲场凝胶电泳分离大的酶切DNA片段，比较指纹图谱来确定细菌的分型,主要用于短期内、较小范围的菌株分析，如医院感染暴发时耐药菌的同源性分析，而MLST通过直接测定多个管家基因的核苷酸序列来确定细菌的ST型，较好地反映出进化和族群生物学变异，两种分型方法在原理和主要目的方面均存在较大差异，故分型结果可能会存在较大不同。

综上所述，广州市医院ICU环境中存在携带OXA-23基因的CRAB克隆传播，应加强细菌耐药监测，采取有效的消毒隔离措施，减少由CRAB引起的医院感染。

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