α,α′-双(对二甲氨亚苄基)环烷酮的合成及其体外光动力抗肿瘤活性

屈小芳，曹亚萍，吴 庆，胡庆红，袁泽利

(遵义医学院 药学院无机化学教研室， 贵州 遵义 563099)

癌症是严重威胁人类生命和社会发展的重大疾病[1]，在我国肿瘤死亡占全部死因的1/4，位居疾病死亡第一位[2]。目前临床上治疗癌症的手段主要有化学治疗、放射治疗、手术治疗、光动力治疗等。光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)因其属于非入侵性的治疗方法，有着创伤小、不良反应少、低积累毒性等优势[3]，在治疗癌症等恶性疾病以及多种良性疾病等方面表现出巨大的应用潜力。

PDT涉及光敏剂、光和氧分子[4]的参与。先经系统或局部给予光敏剂，当光敏剂随血液循环到达病变部位后，利用特定波长激光照射病变部位，使其产生大量的单线态氧(1O2)物种，从而清除病变组织[5-6]。已应用于临床的光敏剂如卟啉、酞箐等具有吸收波长处于近红外区(600～800 nm)的组织穿透性强、产生单线态氧量多等优势[7-8]。然而，这些光敏剂多为混合物(不同异构体混合)，且制备成本高等问题。因而，探寻制备简单、成分单一的处于近红外区的新光敏剂成为研究者们热衷的方向。

α,α′-双(对二甲氨亚苄基)环烷酮类化合物是重要的有机合成中间体，其共轭的π体系，使其结构在光学性能上具有双光子吸收性能，波长接近红光区而常被作为光学材料。此外，该基团也在医药、农药等方面被应用[9-11]，如在抗HIV-1、抗肿瘤等药理活性[12-13]中被作为药学团进行药物设计。如Zou等[14]最近研究表明α,α′-双(对二甲氨亚苄基)结构还具有光辐射产生单线态氧而杀伤肿瘤的活性，这为该结构在医药方面应用奠定了新的基础，但Zou等[14]未基于母核环进行系统扩充及甲基斥电子基团进行研究。为探寻中间母核环烷酮环对光敏剂光动力抗肿瘤活性，本研究构建了3个不同环烷酮母核的α,α，-双(亚苄基)环烷酮先导化合物，其合成路线如图1所示。

图1 目标化合物1的合成

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Varian 1 000 FT-IR红外光谱仪(4 000～400 cm-1，KBr压片，美国Varian公司)，Micromass LCT Premier XE高分辨质谱仪(德国Bruker公司)；Bruker APEX2 Smart CCD型单晶X射线衍射仪(德国Bruker公司)；TU-1901紫外-可见分光光度计(北京谱析仪器公司)；Vary Eclipse荧光分光光度计(美国Varian公司)；安捷伦400 MHz-DD2磁共振仪(美国安捷伦公司)；DHJF-4002低温恒温搅拌反应浴(郑州长城科工有限公司)；CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司)；QB-9001微孔板快速震荡器(上海泸粤明科学仪器有限公司)；Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(美国Thermo 公司)。

对二甲氨基苯甲醛(上海萨恩化学技术有限公司)；环丁酮[韶远科技(上海)有限公司]；环戊酮(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)；环己酮[萨恩化学技术(上海)有限公司]。未经特别说明所用溶剂均为分析纯。

1.2 目标化合物1的合成 以化合物1a的合成为例：将0.532 g(7.59 mmol)环丁酮和0.2 g的氢氧化钠溶于50 mL乙醇和5 mL纯化水溶液中，将其置于低温搅拌反应仪并于-10 ℃下搅拌约5 min，再缓缓加入2.238 g(15 mmol) 的对二甲氨基苯甲醛，继续反应6 h，抽滤，甲醇洗涤，得到黄色固体。用乙醇和二氯甲烷或乙醇重结晶得红色块状晶体1a，产率65%。 m.p.252.0～252.4 ℃。1H NMR(CDCl3,400 MHz),δ(ppm):7.46～7.48(d,4H,J=8.9 Hz,Ar-H),7.14(s,2H,Ar-CH=C),6.69～6.72(d,4H,J=8.8 Hz,Ar-H),3.72(s,2H,-CH2-),3.04(s,12H,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz),δ(ppm):151.23,144.75,141.49,131.51,127.00,123.00,111.96,40.12,35.11; HRMS(ESI-MS),理论计算值C22H24N2O:333.1967(M+H+),实测值：333.203 8; FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr压片):3 448.04,2 916.52,2 852.01,2 803.00,1 696.71,1 648.00,1 588.73,1 525.29,1 479.19,1 365.47,1 311.16,1 236.04,1 169.11,1 133.64,1 091.14,945.25,809.53。按类似方法合成得到1b和1c。

1b:红色针状晶体，产率90%。m.p.300.1～301.4 ℃.1H NMR (CDCl3,400 MHz),δ(ppm):7.53-7.54(d,4H,J=8.0 Hz,Ar-H),7.26(s, 2H, Ar-CH=C)，6.72～6.74(d,4H,J=8.7 Hz,Ar-H),4.08(s,4H,-CH2-),3.04(s,12H,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz),δ(ppm):150.71,133.55,133.48,132.54,124.23,111.87,40.13,26.64; HRMS(ESI-MS),理论计算值 C23H26N2ONa:369.194 3(M+Na+),实测值：369.192 3; FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr压片):3 445.36,3 095.26,2 969.70,2 929.37,1 649.92,1 649.92,1 582.48,1 517.89,1 404.26,1 357.27,1 273.00,1 196.57,1 153.71,1 127.56,1 074.63,1 013.59,969.95,818.05,730.60,517.16。

1c:红色粉末，产率53%。m.p.65.4～66.5 ℃.1H NMR (CDCl3,400 MHz),δ(ppm):7.43～7.45(d,4H,J=8.9 Hz,Ar-H),7.76(s,2H,Ar-CH=C),6.70～6.72(d,4H,J=8.9Hz,Ar-H),3.01(s,12H,-CH3),2.92～2.94(t,4H,J=4.1Hz,-CH2-),1.77～1.82(m,2H,-CH2-);13C NMR (CDCl3,100 MHz),δ(ppm):186.10,146.37,133.05,128.45,120.30,107.67,107.28,36.20,24.78,19.24; HRMS(ESI-MS),理论计算值 C24H28N2O:383.209 9(M+Na+),实测值：383.207 8; FT-IR (4 000～400 cm-1,KBr压片):3 786.98,3 430.66,2 921.30,1 702.68,1 606.47,1 526.18,1 444.36,1 370.02,1 276.88,1 182.04,1 231.74,1 104.18,946.59,825.86,768.56,699.110,619.03,530.82。

1.3 单晶结构测定和解析 将1a固体用乙醇加热溶解后，室温条件下缓慢挥发溶剂，2 d后得到适宜单晶测试的1a。用Bruker APEX2 Smart CCD单晶衍射仪收集数据，采用经石墨单色器单色化的Mo Kα射线(λ=0.071 073 nm)，以φ-ω扫描方式收集单晶衍射数据。得到的强度数据进行经验吸收校正、LP 校正后，采用直接法解得晶体结构，最后用全矩阵最小二乘法修正了全部非氢原子坐标及其各向异性热参数。用SHELX-97程序完成所有计算[15]。

1.4 光学性质测定 将化合物1a～1c用无水乙醇配成浓度为2.24×10-4mol/L，作为储备液，然后各取0.1 mL稀释至10 mL，使其浓度为2.24×10-6mol/L，使用TU-1901紫外-可见分光光度计和Carry荧光分光光度计分别测其紫外-可见吸收光谱和荧光光谱(狭缝宽度均为5 nm，电压为中等)。所得数据用origin 8软件进行处理绘制。

1.5 体外抗肿瘤活性考察 采用MTT法考察化合物1a～1c对 A549(人源肺腺癌细胞)和 HepG2(人源肝癌细胞，2个细胞均来源于遵义医学院医学研究中心)的生长抑制活性。具体步骤如下：取处于对数生长期的肿瘤细胞，接种于96孔板中(2.0×104～5×104个/mL)，放置5% CO2、饱和湿度及37 ℃的培养箱中培养 24 h后[16]，加入5、10、20、40、60、80、100和120 μmol/L的受试化合物，暗室孵育20 h，用光功率为7 mW·cm-2溴钨灯光照15 min，再暗室37 ℃孵育4 h,然后每孔加入10 μL (5 mg/mL)的MTT溶液和90 μL培养基，暗室37 ℃孵育 4 h，将孔内液体吸弃，每孔加入100 μL DMSO，室温下振摇5 min，用酶联免疫检测仪测490 nm OD值。细胞增殖抑制率公式为：抑制率=1-[OD(样品)-OD(空白)]/[(OD细胞对照-OD空白)]×100%。暗毒性考察不需灯照，其他条件同上。

2 结果

2.1 结构表征 以1a的1H NMR为例，在目标化合物的1H NMR中，在δ7.46～7.48 ppm处的双峰为对称芳环上的4个芳环质子化学位移；在δ7.14 ppm处的单峰为新生成的两个烯键质子化学位移；而在δ6.69～6.72 ppm处的双峰为对称芳香环上的4个质子化学位移。此外在δ3.72 ppm处的单峰为环丁酮结构中的亚甲基的2个质子化学位移，而在δ 3.04 ppm的单峰为氨基位取代的12个甲基质子化学位移。1b、1c的1H NMR测试结果与之类似，不同之处在于1b在δ 4.08 ppm处出现了4个环戊酮亚甲基质子化学位移；而1c却在δ 2.94～1.77 ppm处出现了2组6个亚甲基质子化学位移。而在1a的13C NMR谱中，在δ 150～180 ppm处出现了环酮碳基碳信号，在δ 107～144 ppm处为芳环碳和生成的C=C双键碳信号；而19～40 ppm处为亚甲基和甲基碳信号。在1a～1c的HRMS谱图中测定值与理论计算值均在5‰范围内。p在1a～1c的FT-IR谱中，于1 969～1 702 cm-1出现了ÅC=O特征振动吸收峰，在2 852～2 969 cm-1处出现了甲基和亚甲基的特征振动吸收峰。

上述谱图表征充分证实，得到的化合物为预期结构。

2.2 单晶结构 单晶X射线衍射测试表明，化合物1a的晶体结构属于单斜晶系(Monoclinic)，P21/c空间群，分子式为C22H24N2O，晶胞参数为a=7.489(2) Å,b=19.945(6) Å,c=12.403(3) Å,α= 900,β= 96.9650(10),γ= 900,V=1 839.0(9) Å3,Dc=1.201 Mg/m3,μ=0.074 mm-1,Z=4,F(000)=712.0,R1=0.065 5,wR2=0.224 0,s=0.902。晶体数据存于英国剑桥数据中心，CCDC 号为1586168。

1a的分子结构见图2，键长、键角见表1。由图2可以看出，此分子结构中含有2个N,N-二甲基芳香环单元和1个环丁酮单元，芳香环与环丁酮通过环外双键相连。表1的晶体数据表明：环丁酮的C-C键长处于1.47 Å～1.53 Å之间，C=O键长为1.218 Å。环丁酮和芳环之间的双键的C=C键为1.33 Å，而苯环上C=C键处于1.37 Å～1.41Å间，C-N键长在1.42 Å～1.46 Å之间，这些键长与文献报道的键长相吻合[17-18]。同时，环丁酮的键角在90.7o～91.4°，基本上接近90°，键角趋于平均化，有助于化合物结构的稳定[17]，且键角和为359.96°，4个C原子基本处于同一个平面。

图2 化合物1a的分子结构

表1化合物1a的选择性键长(Å)和键角(°)

键长 (Å)键角 (o)C(1)-N(1)1.439(3)C(5)-C(4)-C(3)121.4(2)C(2)-N(1)1.433(4)C(7)-C(6)-C(5)116.2(3)C(3)-N(1)1.375(4)C(7)-C(6)-C(9)123.7(2)C(3)-C(4)1.396(4)C(9)-C(10)-C(11)132.1(2)C(6)-C(7)1.390(3)C(9)-C(10)-C(13)137.1(3)C(10)-C(11)1.478(4)C(11)-C(10)-C(13)90.8(2)C(9)-C(10)1.334(4)O(1)-C(11)-C(10)134.7(3)C(10)-C(13)1.526(3)C(10)-C(11)-C(12)91.1(2)C(11)-O(1)1.221(3)C(11)-C(12)-C(13)90.4(2)C(12)-C(14)1.333(4)N(2)-C(18)-C(17)122.1(3)C(12)-C(13)1.528(4)N(2)-C(18)-C(19)121.9(3)C(18)-N(2)1.364(3)C(3)-N(1)-C(2)121.3(2)C(21)-N(2)1.451(4)C(18)-N(2)-C(22)121.3(3)C(22)-N(2)1.448(4)C(22)-N(2)-C(21)117.1(3)

2.3 化合物1a～1c的吸收光谱和荧光光谱 由图3A可以看出：化合物1a～1c最大吸收波长分别在470 nm、483 nm和447 nm处,它们的吸光度为1a<1b<1c，尤以环己酮生成的1c的吸光度为1a和1b的10倍和13倍。而在荧光发射图谱中(见图3B)，荧光发射峰分别在588 nm、600 nm和567.05 nm处，且荧光强度大小为1a<1c<1b。

图3 化合物1a～1c的紫外-可见光谱(A)和荧光光谱(B)

2.4 体外光毒性 化合物1a～1c避光和光照对人肺腺癌细胞(A549)和人源肝癌细胞(HepG2)受试细胞株的生长抑制活性结果(见表2)。由表2可以看出：3个化合物均无暗毒性，在光毒性方面，化合物1b和1c对受试肿瘤细胞株也无毒性，仅化合物1a对2株受试肿瘤细胞株表现出较强的光毒性，IC50分别5.48 μmol/L、10.50 μmol/L，表明以环丁酮为母核的α,α′- 双(对二甲氨亚苄基)环烷酮作为新光敏剂设计值得进一步深入研究。

表2化合物1a～1c对两种受试细胞的体外抑制活性[IC50/(μmol/L)]

化合物A549暗毒性光毒性HepG2暗毒性光毒性1a>1005.48>10010.501b>100>100>100>1001c>100>100>100>100

3 讨论

α,α′- 双(对二甲氨亚苄基)环烷酮类化合物合成有微波辐射相转移催化法[19-20]、强酸性阳离子交换树脂催化法[21]、ZrOCl2·8H2O催化法[9]等。本研究中，通过加入NaOH碱化溶剂来催化芳香醛与环烷酮进行Cross-Aldol缩合反应。该方法操作简便，催化剂价廉易得，反应环境温和，后处理简单，对于发展化学药物的低碳绿色技术具有十分重要的意义。

光动力治疗是一种利用光动力效应对肿瘤和其他病理性靶组织进行诊断和治疗的新技术[22]。当药物达到病灶组织后，对病灶组织进行光定位照射，从而杀伤病灶组织，而不损伤正常组织。因此，理想光敏剂应具备暗毒性低、对正常组织毒副作用低，且对病灶部位和靶向组织更具有选择性等条件。化合物1a在暗室条件下对细胞的杀伤效应低(即无暗毒性)，在光照下对受试肿瘤细胞株表现出显著光毒性，表明其具备理想光敏剂的无暗毒性条件，值得进一步研究其体内活性。

此外，从药效团结构与光动力毒性方面看，增大母核环烷酮的环系未表现出对受试肿瘤细胞株的光毒性，这可能是由于环系增加导致分子结构更易于扭曲，致使分子共轭较弱，故以小环的环丁酮为母核新光敏剂设计值得进一步开展。

综上所述，本实验在NaOH催化下，将对二甲氨基苯甲醛分别与环烷酮类化合物通过Cross-Aldol缩合生成α,α′-(对甲氨亚苄基)环烷酮1a～1c，并通过核磁1H NMR、13C NMR谱、FT-IR谱、高分辨质谱及单晶XRD等现代分析手段表征为预期目标分子。采用MTT法研究化合物1a～1c避光和光照条件下对人肺腺癌细胞(A549)和人源肝癌细胞(HepG2)受试细胞株的生长抑制活性。结果表明：化合物1a对A549(人肺腺癌细胞)和 HepG2(人源肝癌细胞)均有较强的光毒性，值得进一步研究。

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